黄酒发酵过程中高级醇的影响因素分析

黄酒发酵过程中高级醇的影响因素分析

黄酒是世界上最古老的发酵葡萄酒之一。它起源于中国，被称为世界三大古酒，如啤酒和酒精。绍兴黄酒以糯米为原料,麦曲、酒药为糖化发酵剂,经双边浓醪发酵酿造而成。绍兴黄酒色泽橙黄,质地醇厚,口味甘甜,回味绵长,芳香浓郁,是比较理想的酒精类饮料。黄酒的生产工艺已经非常成熟,一般采用边糖化边发酵的工艺。当黄酒中高级醇含量适中时能使酒体丰富,口感协调,给人以醇厚的感觉。然而,高级醇含量过高时,会对人体产生不良的副作用。高级醇的毒性随分子量的增大而增加,且高级醇的中毒和麻醉作用比酒精强。传统工艺黄酒中高级醇含量过高是导致容易“上头”的主要原因之一。本文研究的是通过改变工艺,采用先糖化再发酵的工艺路线来控制黄酒中高级醇的含量。1材料和方法1.1湖北精神病料麦曲:由浙江古越龙山绍兴股份有限公司提供;菌种:黄酒专用酿酒活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司);糯米:由浙江古越龙山绍兴股份有限公司提供;试剂:酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、硫酸铜、次甲基蓝、甲基红、甲醛、消泡剂;葡萄糖(1g/L)、盐酸(6mol/L)、氢氧化钠(0.1mol/L)。1.2微生物仪器155Agilent6890N气相色谱仪,SPX-250B-Z型生化培养箱,E100尼康生物显微镜,YXQ-LS-SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器,血球计数板,H-2050R离心机,酒精计,pHS-3C型酸度计,78HW-1型恒温磁力搅拌器,BCD-206YHB型海尔电冰箱,电子天平,水浴锅,酸式滴定管,碱式滴定管。1.3方法1.3.1酵母浓度的测定糯米→浸米→蒸饭→接入麦曲、酵母→前酵→后酵原料处理:1000g糯米、浸米(25℃、2d)、蒸煮(常压蒸煮25min左右,熟而不糊、透而不烂、疏松均匀)。酵母活化:20g安琪酵母粉加入300mL2%的葡萄糖溶液中,38℃活化45min。菌体计数:把活化后的酵母菌液4000r/min离心15min,取20g酵母泥加入预先80mL蒸馏水的烧杯中,充分混匀后按梯度稀释,用显微镜和血球计数板计数,计算出酵母浓度。黄酒主发酵:将200g蒸熟的糯米(含有水分)加入到1L锥形瓶中、15g麦曲和150mL水混匀,接入经过活化过的酵母,使醪液中的酵母菌株浓度达到1×107个/mL,在28℃的生化培养箱中前发酵5d,再将温度调到15℃后发酵15d,然后在发酵第1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d、14d、20d每天取样检测。1.3.2菌种活化和菌体计数原料处理:称取1000g糯米,用谷物粉碎机粉碎,制成米粉。按加水比1∶1.5的比例加入1500mL水,搅拌均匀,在92℃的恒温水浴锅内糊化20min,冷却至50℃左右,按15%的比例加麦曲,在50℃的恒温水浴锅内水浴保温糖化10h。酵母活化和菌体计数与双边发酵工艺过程相同。黄酒发酵:将发酵液离心,用乳酸调节pH值至4.0左右,计算体积后平均分装到10个锥形瓶中,高温灭菌,冷却后接入活化后的干酵母(醪液中的酵母菌株浓度1×107个/mL),在28℃的生化培养箱中发酵5d,再将温度调到15℃培养15d,然后在发酵第1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d、14d、20d每天取样检测。1.3.3酸、ph值的测定酵母数、酒精度、氨基酸态氮、总糖、总酸、pH值都按照《黄酒GB/T13662-2008》方法测定,高级醇含量的测定:采用气相色谱外标法测定。2结果与分析2.1这两种工艺对黄酒发酵过程的理化指标的影响2.1.1不同发酵阶段酵母数的变化通过定时取样,测得发酵醪液中的酵母数量,结果见图1。由图1可以看出,2种工艺酵母数量总的变化趋势是先升后降,再趋于相对稳定。在主酵期发酵醪中酵母数急速上升,到第5d时达到最大值。然后醪液降温进入后酵期,酵母数开始慢慢下降,在第10d以后趋于稳定,但整个后酵期酵母数下降幅度并不大,酵母的死亡率也并不高。同时从图1看出,A工艺与B工艺在整个发酵过程中酵母数的变化趋势基本相同,但是B工艺由于经过离心之后,一方面是由于发酵第1d糖含量过高抑制了酵母的繁殖;另一方面是因为发酵液里面缺少很多酵母繁殖所需要的蛋白质、脂肪等物质,故比A工艺的酵母量少。2.1.2b、酵母糖发酵对糖代谢的影响通过对发酵醪液中的酒精度和总糖的测定,结果见图2。由图2可以看出,2种工艺在发酵过程中酒精度一直趋于上升,且主发酵阶段上升速率较大。进入后发酵期后,由于醪液温度降低,酵母衰老以及可发酵性糖含量的降低,使得后酵期发酵醪酒精上升趋缓。同时由图3可以看出,在主发酵阶段,由于醪液中的酵母菌大量生长繁殖,使得其中的大量可发酵性糖被酵母利用。因此在主发酵阶段发酵醪中的糖分下降迅速。对A工艺而言,进入后酵期后,由于酵母活力降低,使得酵母菌对糖分的利用率也下降,但由于此时醪液中糖化酶的酶解活力也相应降低,使得发酵醪中产糖能力也降低,因此发酵醪的糖分仍趋于缓慢下降;而对于B工艺而言,因采用先糖化,后发酵的工艺,使得发酵醪中的糖分一直被酵母利用,发酵阶段不再产糖,使得其糖分也一直呈下降趋势,且由酵母菌的生长繁殖变化而呈现主发酵阶段下降快,后酵阶段下降慢的现象。另外,B工艺主酵第1d,由于是糖液发酵,糖分高对酵母繁殖有抑制作用,酵母少导致其让糖分转化的乙醇少,所以第1d的糖含量比较高,达到48.67g/L;A工艺是边糖化边发酵,有利于酵母的繁殖导致其的糖含量相比较B较少,只有22.00g/L。B工艺的酒精度后酵结束时酒精度10.5%vol比A工艺的11%vol低,是由于其的酵母繁殖受到抑制,营养物质缺乏导致的。2.1.3糖化法:发酵温度对ph值的影响由图4可以看出,A工艺与B工艺的pH值都是先降低再上升再缓慢下降到趋于平衡,这是因为主发酵开始阶段,产酸菌大量产生乳酸和乳酸杆菌素,同时酵母菌也会分泌少量的无机酸磷酸,致使pH值快速下降;随着糖化的进行,酵母大量繁殖,使酒精度升高,抑制了细菌的生长。在后酵开始之后,由于酒精的累积和弱碱性物质的大量增加,这些综合作用使pH值缓慢升高,在第7d时达到最大,随后由于酵母的大量死亡导致发酵变的缓慢,弱碱性物质减少使pH值缓慢降低慢慢趋于稳定。而B工艺第1d发酵时的pH值4.04比A工艺pH值3.85高,是由于糖化液发酵时糖分过高对于产酸菌和酵母繁殖有一定的抑制作用。2.1.4b工艺的总酸发酵工艺在发酵过程中,发酵醪液中总酸生成的情况见图5。由图5可以看出,A工艺的总酸是一直增加。是由于在主酵开始阶段,由于存在各种微生物,使得在开始阶段由于不同微生物的作用使总酸上升较快,在主酵期间从3.05g/L上升为4.84g/L。但随着发酵的进行,酒精浓度的提高,使许多生酸微生物不能在较高酒精度条件下生长而抑制或淘汰,剩下的主要是以耐酒精的酿酒酵母进行发酵,酿酒酵母在发酵期间生酸量不是很大,故其在后酵期间酸度上升非常缓慢,最终达到5.81g/L。而B工艺的总酸第1d4.21g/L比A工艺的3.05g/L高,是由于糖分高有利于一些产酸微生物的生长,故产酸多。但是从第2d开始就一直降低,从最开始的4.21g/L降至2.73g/L,是由于由糖化液发酵的醪液中的营养物质过少,不能被微生物转化成酸,而且部分酸被酵母产生的一些弱碱类物质中和。2.1.5b工艺主要提高氨基酸态氮含量在发酵过程中,发酵醪液中氨基酸态氮生成的情况见图6。由图6可以看出,A工艺在主酵期间由于糯米中的蛋白质不断被酵母分解,导致氨基酸态氮不断地呈上升,从第1d的氨基酸态氮含量0.0271g/L最终达到0.452g/L。在后酵期间由于酵母细胞向胞外分泌多余氨基酸,使酵母衰老和死亡,细胞内蛋白酶被活化,故导致氨基酸态氮一直增加。而B工艺中的氨基酸态氮含量是由0.305g/L逐渐降到0.105g/L,是由于发酵前期,酵母处于对数生长期,含氮化合物被用于合成酵母细胞蛋白质、核酸和其他含氮化合物,使糖液的氨基酸态氮迅速下降;而在发酵后期,糖液中蛋白质的缺乏导致氨基酸态氮逐渐减少,最后慢慢趋于稳定。而B工艺第一天的氨基酸态氮含量0.305g/L比A工艺的0.0271g/L高很多,是因为在糖液制作过程中麦曲中的蛋白酶在适宜的条件下已经将糯米中的大部分蛋白质分解成氨基酸。2.22三种工艺对黄酒发酵过程中乙醇的积累2.2.1线速、水流、流速本实验采用气相色谱法外标法测定黄酒中的高级醇,气相色谱条件:GC-2014C气相色谱仪、氢火焰离子化检测器(FID)、毛细管色谱柱:FFAP(30m×0.20mm×0.25μm);氢火焰温度270℃,进样口温度250℃;H2流速:40.0mL/min,N2流速:30mL/min,空气流速:400mL/min;分流比:10∶1,色谱柱流量:1.3mL/min;线速度:37.4cm/min,总流量:17.3mL/min。柱温程序升温:初始温度60℃,恒温1min,以5℃/min升温至120℃,恒温1min以后以10℃/min升温至220℃,恒温7min。2.2.2不同工艺发酵过程中高级醇的变化用气相色谱法测得2种工艺发酵过程中高级醇含量的变化,结果见图8。同时对发酵结束后酒样中主要的高级醇含量进行了检测,结果见表3。由图8可以看出,A与B不同工艺路线在发酵结束后酒样中的高级醇含量分别为399.45mg/L和329.26mg/L。首先是由于糯米经过麦曲的糖化产生大量的葡萄糖经过合成代谢途径产生高级醇;其次糯米中的蛋白质被麦曲中的蛋白酶分解产生氨基酸,再经过降解代谢途径产生高级醇。由图8还可以看出,高级醇含量是一直增加的,是由于酵母一直在发酵产生高级醇,导致高级醇一直在增加,在主发酵时期酵母大量繁殖,代谢旺盛,产生的醇类物质多,而在后发酵期间是缓慢上升是因为酵母代谢活动都趋于稳定,可用于产生高级醇的糖分和蛋白质减少。而B工艺比A工艺高级醇第1d含量低,是由于刚开始糖分多,酵母代谢受到抑制产生的高级醇比较少。最后B工艺比A工艺高级醇的含量少是因为前者糖液发酵由于缺少蛋白质和糖类物质,对高级醇生成的两条合成途径都有很大的影响。由表3可以得出B工艺黄酒发酵液中所含的异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇相比于A工艺发酵液少。再通过对高级醇比值进行比较,高级醇比值就是指酒液中高级醇含量与酒液中酒精含量的比值。A工艺高级醇指数为3.63×10-5,B工艺高级醇指数为3.13×10-5,B工艺比A工艺的高级醇与乙醇的比值低。3不同工艺路线下小麦高级醇和苯乙酸酯的代谢糯米→粉碎→加水高温糊化→冷却→加麦曲→保温糖化→分离→调pH值→接入酵母→前酵→后酵3.1通过对2种工艺路线的对比,先糖化后发酵工艺与双边发酵工艺酒样中还原糖消耗、生物量变化以及酒精的生成趋势都较为相似,发酵结束后前者的酒精含量要略低于后者;前者氨基酸态氮和总酸含量是逐渐降低,而后者氨基酸态氮和总酸含量是逐渐增加。3.2比较2种工艺路线发现先糖化后发酵工艺黄酒的样品中,后酵结束时高级醇含量为329.2