两性霉素b及其脂质体效价的测定

两性霉素b及其脂质体效价的测定

两性霉素b是大多数深层细菌感染的重要药物。传统的注射用两性霉素B制剂在治疗过程常产生较严重的毒副作用,应用受到限制。随着制剂技术的发展,新型的两性霉素B脂质体(liposomalamphotericinB,L-AMB)的毒性反应已显著降低,且疗效与传统的制剂相当或较好,极大地促进了两性霉素在临床中的应用。对两性霉素B的测定,有文献报道用HPLC法测定其纯度,但目前各国药典均采用管碟法测定其效价。管碟法操作繁琐,耗费时间长,影响因素多,重现性差。采用浊度法测定可克服上述不足。浊度法测定两性霉素B效价的报道不多,本文建立了利用浊度法测定两性霉素B及其脂质体效价的方法。1仪器和试剂1.1仪器、饮料和仪器845x-安捷伦紫外可见光谱仪(HP);CZB-1抗生素比浊法测量仪、玻璃培养杯(厚度1cm),北京潮声公司;AE-240电子天平(Mettler公司);WGP-600隔水式电热恒温培养箱。1.2材料和培养基啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)9763和白念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)98001由中国药品生物制品检定所提供。两性霉素B标准品(批号0334-843502,效价855μg/mg)由中国药品生物制品检定所提供。两性霉素B原料样品(批号2001-05-01、AI030701、AO031203、AC021205)和两性霉素B脂质体(批号010101B、050205、050204、050106,每瓶10mg)由上海先锋药业公司提供;批号042810KD(每瓶50mg)为Nexstar公司产品;批号042091AD(每瓶50mg)为GileadSciences有限公司产品。新制培养基(蛋白胨7.5g,酵母膏2.0g,牛肉浸膏1.0g,氯化钠5.0g,葡萄糖10.0g,加水制成1000ml,pH6.5),真菌培养基,酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD),YPD液体培养基,灭菌生理盐水和磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)均按中国药典2005年版二部附录配制。二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)和曲拉通(TritonX-100)为分析纯试剂。2价格测定2.1主流管的方法按中国药典2005年版二部方法测定。2.2浊度法2.2.1菌苔藓的培养取啤酒酵母新鲜斜面培养物,接种于YPD斜面上,置35～37℃培养18～23h,用灭菌生理盐水洗下菌苔,加生理盐水稀释,使其在650nm波长处的吸光度约为1.0。取菌液2～3.3ml加至培养基100ml中,摇匀,为实验菌液。2.2.2溶液的制备(1)甲基甲酰胺溶液配制取两性霉素B标准品适量,精密称定,用DMSO适量溶解,二甲基甲酰胺稀释成100μg/ml的溶液,作为储备液备用;精密量取储备液适量,用二甲基甲酰胺稀释制成5μg/ml的标准品溶液;用磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至实验浓度。(2)甲基甲酰胺溶液取两性霉素B原料适量,精密称定,用DMSO适量溶解,二甲基甲酰胺稀释成约100μg/ml的溶液;精密量取适量,用二甲基甲酰胺稀释制成约5μg/ml的供试品溶液;用磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至实验浓度。(3)甲基甲酰胺溶液精密称取两性霉素B脂质体适量,加5%曲拉通(TritonX-100)的乙醇溶液(每相当于1mg两性霉素B的制剂中加1ml),振摇,再加二甲基亚砜适量溶解(必要时可超声),混匀,用二甲基甲酰胺稀释制成约100μg/ml的溶液;精密量取适量,用二甲基甲酰胺稀释制成约5μg/ml的溶液;磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至实验浓度。2.2.3比浊法测量,培养“高效水”的人才取标准品溶液1.0ml,加入灭菌培养管中,再加入实验菌液9.0ml,置抗生素比浊法测量仪内,于(37±1)℃培养。另取稀释溶剂1.0ml,加9.0ml空白培养基,混匀,作为空白对照,仪器在线于530nm波长处测定各管啤酒酵母对数生长期内不同培养时间下的吸光度值(A)。根据量反应平行线原理计算供试品的效价值。3结果3.1测量条件的选择3.1.1实验菌的确定两性霉素B为抗真菌抗生素,因此选择白念珠菌和啤酒酵母作为实验菌;在真菌培养基、YPD液体培养基和新制培养基中培养,加菌量分别为1%、2%、3%;抗生素浓度为0.0179～0.4478μg/ml。绘制菌株在不同加菌量、不同培养基及不同抗生素浓度的生长曲线。根据菌生长曲线及在不同抗生素浓度下菌液吸光度值的变化,发现白念珠菌和啤酒酵母在新制培养基中生长,对不同浓度的抗生素更敏感,即菌液的吸光度值差(⊿A)大;在其它培养基中菌液易沉降;因此选择新制培养基作为实验培养基。以白念珠菌为实验菌时,抗生素的线性浓度范围0.059～0.098μg/ml;以啤酒酵母为实验菌时,抗生素的线性浓度范围0.04～0.1μg/ml,啤酒酵母的线性浓度范围宽,故选择啤酒酵母作为实验菌。加菌量为1%时,至适宜的菌液测定浓度时间长,测定时可利用的浓度范围窄,2%～3.3%的加菌量较适宜测定。3.1.2dmso和dmf对菌生长的影响对不同量的溶解溶剂DMSO及稀释溶剂DMF进行实验。结果表明,DMSO在8%以下、DMF在2%以下的磷酸盐缓冲液(pH6.0)对菌生长没有影响;4%的DMF、10%的DMSO对菌生长略有抑制;DMF加入量越大,对菌的抑制作用也越大,因此DMSO和DMF的最终加入量应分别小于8%和2%。脂质体测定时,分别对以水、乙醚、乙醇、甲醇、2%或5%曲拉通(TritonX-100)的乙醇溶液等溶解溶剂进行比较,发现脂质体在2%和5%曲拉通乙醇溶液中澄清,且回收率满足实验要求;此条件下曲拉通乙醇溶液对菌生长无影响。3.1.3实验结果分析抗生素效价测定中,抗生素的不同浓度(C)与菌液的吸光度值(A)通常并不完全呈线性,此时需将其转化为线性函数。利用不同的函数(A～C、A～lgC、lgA～C、lgA～lgC)对实验数据进行分析,并利用SAS软件对不同培养时间点的数据进行回归显著性、剩余标准差等统计分析,不同直线间的平行性显著性测验(t检验),结果表明A～C、A～lgC、lgA～C三种函数的线性范围宽,回归显著,剩余标准差小,直线的相关系数大,考虑到生物检定一般习惯上用函数A～lgC,因此利用此函数进行效价测定。3.1.4菌生长曲线对不同加菌量(2%～3.3%)及菌的不同传代次数进行比较,以不同抗生素浓度下的吸光度值A为纵坐标,培养时间t为横坐标,绘制菌生长曲线(A～t)(图1)。由菌生长曲线得出,不同抗生素浓度下的啤酒酵母,培养约4h进入对数生长期;比较不同抗生素浓度下的菌液A～t生长曲线发现传代不同次数的菌液及不同的加菌量,菌的平稳生长时间均在6～8h,因此选择测定时间为6～8h。比较培养6～8h不同时间点的A～lgC曲线(图2),发现菌液的吸光度值A在0.4～1.3之间,便于测定,据此确定抗生素浓度的测定范围。3.2噪声法的建立和评价3.2.1标准曲线及效价值的测定精密量取5μg/ml标准品溶液,用磷酸盐缓冲液(pH6.0)分别稀释成0.04、0.05、0.06、0.08和0.10μg/ml的标准曲线溶液;用磷酸盐缓冲液(pH6.0)将供试品溶液稀释成约0.08μg/ml的浓度;分别量取上述一系列标准曲线溶液和供试品溶液1.0ml,加入灭菌培养管中,每个浓度3～6管,再分别加入实验菌液9.0ml,置抗生素比浊法测量仪内,于(37±1)℃保温培养,6h后每4min记录各管的A值;计算标准曲线,并根据标准曲线计算供试品的效价;当连续5点供试品的效价值误差(RSD)小于2%时,终止实验,以5点的均值表示供试品的效价。抗生素浓度在0.04～0.10μg/ml时,吸光度值A与抗生素浓度对数lg(100×C)成良好的线性关系(r=0.982～0.995),直线回归显著性(P<0.01)。分别精密量取100μg/ml的标准品、脂质体储备液等体积置于同一容量瓶中,用二甲基甲酰胺稀释制成5μg/ml的混合溶液,测定方法的回收率。平均回收率为103.5%(n=5),RSD为6.22%。对同一个样品溶液测定,日内RSD为1.64%;日间RSD为2.79%(n=8)。分别对4批两性霉素原料和6批两性霉素脂质体进行测定并与管碟法结果比较(表1),两者无显著性差异。3.2.2加标回收率试验根据标准曲线法实验结果,选择0.06和0.075μg/ml为二剂量法测定浓度;用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)分别稀释标准品与供试品溶液;每个浓度6管,于(37±1)℃保温培养,6h后每4min记录各管的A值;按中国药典2005年版二部生物检定统计方法(附录ⅩⅣ)中的2.2法计算供试品的效价;当连续5点供试品的效价值误差(RSD)小于2%时,终止实验,以5点的均值表示供试品的效价。二剂量方法的平均回收率(制备样品方法同标准曲线法)为106.6%(n=2),RSD为1.97%。对同一个样品溶液测定,日内RSD为0.38%(n=2);日间RSD为0.87%(n=3)。分别对4批两性霉素原料和6批两性霉素脂质体进行测定并与管碟法结果比较(表1),两者无显著性差异。4测定菌液密度的控制两性霉素B是含有多个小组分的共轭七烯大环内酯类抗生素,分子结构中含有活性羧基、氨基及多个活性羟基,为两性化合物,采用管碟法测定时,受扩散系数、啤酒酵母菌落颜色、培养基本底色、抑菌圈大小等诸多因素的影响。浊度法测定在液体培养基中进行,可避免上述因素的影响;用分光光度仪测量菌液的吸光度其精密度优于管碟法中对抑菌圈的测定,且培养时间短,因此测定更为快速、准确。采用一剂量法测定时,标准曲线低浓度范围测定误差较大(相对误差3.79%～7.36%);高浓度范围测定误差较小(相对误差1.18%～4.05%)