甘露聚糖复合物的制备及其在饲喂中的应用

甘露聚糖复合物的制备及其在饲喂中的应用

努马可林糖（mos）是一种由母系膜外包的白色糖蛋白。研究甘露聚糖的结构,不但有利于阐明酵母细胞壁的结构与功能,而且还有利于酵母细胞接合时的细胞识别因子的研究。近年来研究发现,MOS在微生物之间和微生物与动物细胞相互作用中发挥着重要作用。众所周知,当消化功能不正常时,乳杆菌会大量减少。因此,促进消化道内有益菌生长,抑制病原菌繁殖,维持消化道菌群动态平衡,减少抗生素的使用是目前研究的热点。近几年,人们对寡聚糖在动物保健方面作用认识日趋深入,发现MOS能刺激乳酸菌、双歧杆菌等有益微生物的迅速生长和繁殖,抑制大肠杆菌的生长繁殖;MOS还能有效地与沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱菌等病原微生物细胞壁上的受体结合,从而阻止了病原菌与消化道上皮细胞的结合,使病原菌通过消化道而不损害寄主动物;此外,MOS还能刺激腹膜巨噬细胞产生干扰素,促进细胞产生抗体,增强机体的非特异性和特异性免疫反应,提高机体的抗病能力。笔者对酵母甘露聚糖的制备进行了初步研究,分析了MOS的化学组成,并通过测定鸡消化道大肠杆菌和乳杆菌的变化来评价日粮中添加MOS对动物健康的影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验动物1日龄AA鸡。1.1.2培养基的制备啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)由浙江大学饲料科学研究所提供。液体培养基为麦芽汁培养基,0.054MPa灭菌20min;固体培养基为在麦芽汁培养基中加入2%琼脂。培养方法:500mL三角烧瓶中装液量150mL,(30±1)℃,200r/min振荡培养3d,然后收集细胞。1.1.3菌种培养和培养称取新鲜成型粪便1g加入99mL生理盐水,150r/min振荡10min,然后依次递增稀释10倍至1×10-7,取0.5mL加入到灭菌培养皿内,用倾注平板法培养乳杆菌(Lactobacillus),用涂布法培养大肠杆菌(E.coli)。乳酸菌采用LBS琼脂,37℃培养48~72h;大肠杆菌采用麦康凯培养基,37℃培养48h。根据选择性培养基、菌落形态、大小、颜色、革兰氏染色特点和细菌形态进行鉴定,选择其适当稀释度的平板进行计数,并计算出每克粪便所含的细菌数,以对数表示。1.2小鼠粪便中杆菌数目和粗蛋白及氨基酸含量测定试验一:1日龄AA鸡16羽,随机分成2组,每组8羽,其中一组为对照组,另一组为在同等日粮中添加0.5%MOS的试验组,在试验第10日测定粪便中大肠杆菌和乳杆菌数目;试验二:1日龄AA鸡30羽,随机分成2组,每组15羽,其中一组为对照组,另一组为添加0.5%MOS的试验组,每间隔5d测定粪便中大肠杆菌和乳杆菌数目。试验期内自由采食和饮水,24h光照。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定;蛋白质测定参照Bradford方法;总糖采用苯酚-硫酸法测定;糖的分析采用薄层层析技术;氨基酸含量测定采用OPA柱前衍生法,KNAUER氨基酸全自动分析仪。数据均采用SAS(6.03版)中的t检验方法,进行差异显著性检验。2结果2.1黄流岩的制备酵母甘露聚糖(MOS)是细胞壁外的多糖,根据多糖的特性,经过反复试验和分析,确定了如下提取工艺:第一步:啤酒酵母经离心,用蒸馏水洗后重复离心三次,然后用丙酮干燥得干燥粉;第二步:取丙酮干燥粉,加入0.02mol/L柠檬酸缓冲液(pH7.2),120℃水解90min,水解液离心,弃沉淀,取上清液,加入醋酸钠和三倍体积的无水乙醇,离心得沉淀,重复一次,然后将沉淀溶解于重蒸馏水中,用重蒸馏水透析24h,浓缩得黄棕色稠度溶液;第三步:在浓缩液中加入蒸馏水和7.2%溴代十六烷基三甲铵,室温过夜,离心,弃沉淀,取上清液,加入1%硼酸,在不断搅拌下,用1mol/L氢氧化钠调节pH至8.8,4℃放置过夜;第四步:将上述溶液离心,弃上清液,取沉淀物,然后用0.5%pH8.8硼酸钠洗涤离心,弃上清液,在沉淀物中加入0.5%的pH8.8硼酸钠、醋酸钠和三倍体积的无水乙醇,离心得沉淀,再加入含2%乙酸的乙醇溶液,离心,取沉淀物,最后加入无水乙醇离心得到成品(MOS)。2.2mos的蛋白质含量从图1可知,酵母的蛋白质含量为48.56%,总糖为38.86%,MOS的蛋白质含量为4.15%,总糖含量为90.12%,从而表明了提取过程中去除了大多数蛋白质,但MOS是含蛋白质的多糖。2.3mos的双糖原理图2表明,MOS的甘露糖含量为73.2%,而葡萄糖为2.3%,甘露糖/葡萄糖比值为31.8%,甘露糖/总糖比值为81.24%,说明MOS的甘露糖含量很高,因而是一种甘露聚糖。2.4mos的氨基酸含量酵母中各种氨基酸都高于MOS,并且谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和赖氨酸等含量较高;而MOS中苏氨酸和丝氨酸相对较高。酵母蛋白质的氨基酸总和为45.08%,MOS为6.02%,说明在提取过程中大部分杂蛋白已被去除,剩余的氨基酸和甘露糖碳链相结合,从而形成含蛋白质的甘露聚糖复合物。2.5mos蛋白的相对含量图3为酵母和MOS蛋白质中各种氨基酸的相对含量,结果表明MOS蛋白质中苏氨酸和丝氨酸含量最高,谷氨酸和天门冬氨酸次之,而组氨酸、酪氨酸和蛋氨酸的含量较低。2.6著生杆菌数量,乳杆菌数量极显著提高研究结果表明(图4),在饲料中添加MOS饲喂雏鸡至第10日,可使粪便中的大肠杆菌数量显著降低(P<0.05),而乳杆菌数量极显著提高(P<0.01)。每隔5d检测大肠杆菌和乳杆菌的结果表明(图5),大肠杆菌数量随着时间的延长而减少,乳杆菌数量增多,但二者随时间的延长而变化趋缓,大肠杆菌和乳杆菌在第15日和第20日时,二者的数量已无显著差异。3露聚糖混合物的营养成分3.1在MOS提取过程中会失去部分的总糖量,这些是不能被沉淀的小分子糖类,在提取过程中必须保持pH的均匀性,避免局部过碱,以免发生β-消除反应,使寡糖链水解。由于在酵母细胞壁外存在着分子量大小不匀的甘露聚糖复合物,因此通过该提取工艺得到的甘露聚糖需采用离子交换柱和电泳等方法进一步分离纯化。啤酒酵母中含蛋白质为48.56%,总糖含量为38.86%;提取的甘露聚糖复合物含蛋白质为4.15%,总糖含量为90.10%,其中甘露糖为73.2%。该结果表明,甘露聚糖复合物是一种含蛋白的多糖。虽然人们认为从真菌中分离得到的多糖含α和β连接键,但主要的还是α-连接键,而酵母甘露聚糖连接键的主要类型需进一步的探讨。甘露聚糖复合物中的蛋白质具有一定的特征性,苏氨酸和丝氨酸含量较高,这表明甘露聚糖的大量碳水化合物短链与多肽残基上的羟基相结合,此外天门冬氨酸和谷氨酸的含量相对较高,而蛋氨酸含量较少。3.2根据竞争性排斥的作用原理,动物消化道内的正常菌群对维持宿主消化功能,抑制病原菌在肠道内大量繁殖起着十分重要的作用。选用乳杆菌作为指标的意义在于它是消化道内生理性有益菌,是一种优势菌种,具有维持消化道菌群平衡的作用。乳杆菌能在消化道内迅速繁殖;另外,乳杆菌产酸能力强,能在较短时间内产生大量的酸,使肠道内的pH和Eh下降,不