高效液相色谱法测定尿中

高效液相色谱法测定尿中

苯二甲酸（tpa）是世界上最常见的生产和利用材料之一。它主要用于生产结晶、脂肪和聚酯纤维。目前，中国的生产和使用也非常广泛。常用的TPA检测主要是分光光度法,由于其灵敏度和特异性均较低,不能适应生物材料的检测。近年来的研究结果表明进入体内的TPA主要以原形经尿排出体外。尿中TPA的变化基本上能反映出体内TPA的吸收与排泄情况。因此,我们研究了采用高效液相色谱法(HPLC)测定接触工人尿中TPA的含量的方法,以期达到为接触人群TPA生物学临测,TPA毒理学研究及TPA的职业卫生标准的制定提供方法和依据。1材料和方法1.1仪器Waters高效液相色谱仪,配备510泵、996二极管矩阵检测器、2010色谱工作站。1.2成品白砂糖TPA对照品(纯度99.99%),由中国扬子石化总公司提供,用1%氢氧化钠溶解制1mg/ml的贮备液备用,氯化四丙胺(纯度99%),Sigma化学公司产品,用去离子水溶解制成5mM的溶液备用,甲醇,色谱纯,江苏省淮阴精细化工厂生产;醋酸乙酯,分析纯,南化学试剂厂生产。1.3无tpa接触史个体选择某大型企业接触TPA粉尘的作业工人群,工人留取当天工前工后尿样,置-20℃冰箱保存备用,对照组为无TPA接触史的同单位行政工作人员。1.4方法1.4.1流动相bondpak色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱,粒度10μm,规格4.6250mm不锈钢柱(μBondapakC18);流动相:甲醇-5mM氯化四丙胺水溶液(1∶9v/v)(ph760);流速1.5ml/min;检测波长:238nm。1.4.2标准曲线的绘制精密吸取等份的无TPA接触史人员的尿样若干份,每份2ml,加入不同量的TPA对照品溶液,制成含TPA浓度分虽为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μg/ml标准系列,分加0.2ml10%高氯酸溶液,混匀,分别精密加入2ml醋酸乙酯涡流混旋萃取1min,缓慢加入0.1ml无水乙醇后静置分层,精密吸取上层清液1ml置5ml具塞离心管中,置60℃水浴中用氮气吹干,残渣用0.5ml无水乙醇溶解,取10μl注入液相色谱仪,记录色谱图,测定TPA峰峰面积,以TPA的浓度为自变量(x),以TPA峰峰面积为自变量(X)的函数(Y),计算TPA标准曲线的回归方程。Y=19397.4406X-3306.6124;相关系数r=0.9997;线性范围0.1—20μg/ml。1.4.3尿样中tpa的含量测定精密吸取解冻尿样2ml,置5ml具塞离心管中,加0.2ml10%高氯酸溶液,混匀,照TPA标准曲线项下的步骤,测定尿样中TPA峰峰面积,并代入TPA标准曲线回归方程计算尿样中TPA的含量。2结果与讨论2.1不同ph下醋酸乙酯对尿样萃取效率的影响精密吸取等份的加标尿样(含TPA5.0μg/ml)若干份,每份2.00ml,置5ml具塞离心管中,分别用10%高氯酸和0.1mol/L氢氧化钠调节各样品的pH值分别为0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、8.0、10.0分别用2.0ml醋酸乙酯萃取1min,照标准曲线项下的步骤测定每份尿样中TPA的含量,并计算不同pH时的萃取效率,结果见表1。结果显示pH在1～3范围内TPA的提取效率最高,相应10%高氯酸用量为0.1～0.3ml,将10%高氯酸用量控制为0.2ml。2.2提取溶剂的确定精密吸取等份的加标尿样(含TPA5.0ug/ml)若干份,每份2.00ml,置5ml具塞离心管中,加入0.2ml10%高氯酸溶液,混匀,分别用1ml正已烷,环己烷,三氯甲烷,二氯甲烷,石油醚,正丁醇,醋酸乙酯涡流混旋萃取1min,照标准曲线项下的步骤测定每份尿样中TPA的含量,并计算每种溶剂的提取效率,结果见表2。结果显示,在所用的溶剂中醋酸乙酯的提取效率最高,达98.67%。2.3酯酸乙酯萃取精密吸取等份的加标尿样若干份,每份2.00ml,置5ml具塞离心管中,分别加入0.2ml10%高氯酸溶液,混匀,分别用酯酸乙酯萃取:2ml×1,2ml×2,2ml×3。合并萃取液于具塞离心管中,置60℃水浴中用氮气吹干,照标准曲线项下的步骤测定每份尿样中TPA的含量,并计算不同萃取次数的提取效率,结果见表3.结果提示无论是较高(10μg/ml)或较低浓度(5μg/ml)的TPA尿样,醋酸乙酯的提取次数对尿中TPA的提取效率均不存在明显的差异。2.4加标回收率测定精密吸取等份的无TPA接触史人的尿样若干份,每份2.00ml,置5ml具塞离心管中,准确加入TPA对照品适量,混匀后分别加入0.2ml10%高氯酸溶液,混匀,照标准曲线项下的步骤测定每份尿样中TPA的含量,根据测得量和加入量计算测定方法的回收率,结果见表4。结果表明该方法的测定回收率为98.80%±4.23,变异系数(RSD)为42.8%。2.5高效液相色谱法利用本法测定56名接触工人工前、工后尿TPA含量,同时测定尿肌酐(Cr)的含量,以此校正尿TPA的含量,结果分别为5.69±2.91mmol/molCr、15.87±5.97mmol/molCr,对照组尿TPA未检出。文献报道尿样稀释后直接测定,灵敏度相对较低,仅适用于高浓度尿TPA含量的测定。本方法采用醋酸乙酯萃取法,提高了TPA含量测定的灵敏度,方法的特异性好,具有较宽的线性范围,在0