人骨肉瘤细胞mg63中foxm1基因表达及对细胞增殖与凋亡的影响

人骨肉瘤细胞mg63中foxm1基因表达及对细胞增殖与凋亡的影响

中国肿瘤防治杂志，2014年21（20）：1575-1579。骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,其恶性程度高,血行转移发生早,具有较高的局部浸润和早期转移倾向,是导致患者死亡最主要的原因。ForkheadboxM1(FoxM1)是叉头框转录因子家族成员之一,基因定位于12p13-3,长约23kb,普遍表达于增殖活跃的细胞,与DNA损伤修复、组织稳态及细胞凋亡等过程密切相关。近年来研究表明,FoxM1在多种恶性肿瘤中均存在高表达,其中包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。FoxM1在人骨肉瘤中亦存在高表达现象。本研究以特异性siRNA干扰骨肉瘤细胞株FoxM1表达,观察其对细胞增殖与凋亡的影响,初步在细胞与分子水平了解FoxM1调控细胞增殖与凋亡的机制。1材料和方法1.1试验兔抗兔模型人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所保存。MEM和RPMI1640培养基购于美国Corning公司,胎牛血清购于美国Gibco,胰蛋白酶和四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司,LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司,二甲基亚砜(DMSO)购于美国Ventec公司,酶标仪(Bio-Rad680,USA),低温离心机(Beckman,USA);兔抗人FoxM1、β-actin(CST,USA)HRP标记羊抗兔IgG购于美国Pierce公司,TotalRNAKitⅡ购于美国OMEGA公司,PrimeScriptRTreagentkit、RealtimePCRkit购于日本TaKaRa公司,FOXM1-siRNA及阴性对照siRNA序列由上海吉玛公司合成。流式细胞术检测在第四军医大学基础部免疫学教研室进行。1.2细胞培养及转染MG63和SOSP-9607细胞分别培养于含10%胎牛血清的MEM和RPMI1640培养基中,置于37℃、5%CO2中传代培养,并取对数生长期的细胞用于实验。1.3sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳取生长状态良好的MG63和SOSP-9607细胞,冰上裂解细胞提取总蛋白并BCA法进行定量,调整样品浓度。上样30g/孔,行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,100V湿转90min;含5%脱脂奶粉的TBST液封闭2h;抗FoxM1和抗β-actin4℃孵育过夜,相应二抗室温2h;洗涤后ECL显色,置入仪器观察,拍照记录。1.4g膜转染及细胞培养针对FoxM1的特异性siRNA正义链为5′-GGA-CCACUUUCCCUACUUUTT-3′,反义链为5′-AAA-GUAGGGAAAGUGGUCCTT-3′;阴性对照序列正义链为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反义链为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染前将MG63细胞以每孔1×105的密度接种于6孔板中培养,待细胞处于对数生长期并且融合度达60%时进行转染。将MG63细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,前两者分别转染特异性siRNA和阴性对照siRNA,空白对照组细胞不处理,每组设3个复孔。转染时以Opti-MEM无血清培养基稀释siRNA序列与LipofectaminTM2000,参照LipofectaminTM2000说明书进行,转染终体积为2mL/孔,siRNA转染浓度为100nmol/L,转染后8h换液,添加含胎牛血清10%的培养基。实验重复3次。1.5rt-pcr检测于转染后72h收集各实验组细胞,提取总RNA,采用SYBRGreenⅠ染料法检测各组细胞FoxM1基因表达水平。FoxM1基因PCR引物序列上游为5′-G-AAGAACTCCATCCGCCACA-3′,下游为5′-GCCT-TAAACACCTGGTCCAATGTC-3′;β-actin引物序列上游为5′-TGGCATTGTTACCAACTGGGTC-3′,下游为5′-TCACGGTTGGCCTTAGGGTTC-3′。按荧光实时定量RT-PCR试剂盒说明书进行,PCR反应条件94℃预变性6min,95℃变性10s,60℃退火1min,共进行40个循环;循环结束后71℃保温30s,所得结果进行读数分析。采用相对定量法,分析实验组、阴性对照组及空白对照组细胞转染48h后的ΔCt值,计算ΔΔCt,进而换算为2-ΔΔCt(设空白对照组表达量为1),即为转染48h后各组FoxM1相对表达量。1.6总蛋白的提取采用蛋白质印迹法检测。转染后72h收集各组细胞各3孔,裂解并提取总蛋白,其余步骤同实验1.3。各组蛋白表达的灰度值利用QuantityOne进行测定,以FoxM1蛋白与β-actin蛋白条带灰度值的比值作为FoxM1基因的蛋白表达水平。1.7实验细胞和人工诱导的活性人基因文库建立采用MTT法检测,实验分组同1.4。将MG63细胞以8×103个/孔接种于96孔板培养,每组细胞设4个复孔,周边孔以无菌双蒸水代替,共铺4块96孔板,培养过夜,于对数生长期按照实验1.4转染特异性siRNA及阴性对照siRNA。在转染后24、48、72和96h各取1块96孔板,加入新鲜MTT溶液20μL/孔;37℃孵育4h后,避光小心吸取上清液,每孔加入200μLDMSO溶解,酶标仪中震荡10min,在490nm(参考波长630nm)处测量并记录每孔的光密度A值(A490)。每组细胞4复孔光密度A值取平均值,以时间为横坐标,A平均值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。1.8细胞凋亡检测采用流式细胞仪检测,实验分组同1.4。转染后72h用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,培养基洗涤1次,AnnexinⅤ-PI法上机检测细胞凋亡。实验重复3次。1.9多因素方差分析采用SPSS18.0进行统计学分析,计量资料以ue0af±s表示,对多个样本均数进行完全随机设计的单因素方差分析(One-wayANOVA),各均数间两两比较行LSD-t检验。检验水准α=0.05。2.结果2.1基因发现福斯图1蛋白质印迹法检测结果显示,在人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表达。2.2各组机构间增强党员社区开发ccm1mrna的表达水平比较图2Real-timePCR检测结果显示,实验组、阴性对照组和空白对照组FoxM1mRNA表达水平分别为0.39±0.09、0.91±0.07和0.96±0.08,3组间FoxM1mRNA表达水平不同,F=46.22,P<0.001;实验组FoxM1mRNA表达水平显著低于阴性对照组,t=7.92,P<0.001,比阴性对照组下降64%;也低于空白对照组,t=8.68,P<0.001;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义,t=0.76,P=0.475。2.3组间保血蛋白表达水平比较图3蛋白质印迹法检测结果显示,实验组、阴性对照组和空白对照组FoxM1蛋白表达水平分别为0.31±0.06、0.81±0.10和0.89±0.09,3组间FoxM1蛋白表达水平不同,F=40.98,P<0.001;实验组FoxM1蛋白表达水平显著低于阴性对照组,t=7.20,P<0.001,比阴性对照组下降约60%;也低于空白对照组,t=8.35,P<0.001;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义,t=1.15,P=0.29。2.4各组间增殖率图4MTT检测结果显示,实验组、阴性对照组和空白对照组MG63细胞增殖率分别为0.36±0.03、0.61±0.02和0.65±0.02,3组间增殖率不同,F=130.77,P<0.001;实验组增殖率显著低于阴性对照组,t=12.86,P<0.001;也低于空白对照组,t=14.92,P<0.001;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义,t=2.06,P=0.085。2.5各组凋亡率的情况图5流式细胞术结果显示,实验组、阴性对照组和空白对照组MG63细胞凋亡率分别为(13.69±1.15)%、(2.38±0.90)%和(2.87±0.86)%,3组间凋亡率不同,F=128.075,P<0.001;实验组凋亡率显著高于阴性对照组,t=14.16,P<0.001;也高于空白对照组,t=13.54,P<0.001;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义,t=0.61,P=0.562。3核心分子—讨论FoxM1作为人FOX转录因子家族中的一员,是经典的增殖相关因子,与PIK-1、Survivin和CDC25B等有丝分裂因子相互作用调控细胞周期的进程,进而影响细胞增殖与凋亡。FOXM1表达水平与细胞增殖密切相关,其异常高表达对肿瘤细胞不可控性的恶性增殖意义重大,在恶性肿瘤的发生与发展过程中发挥了重要作用,涉及肿瘤细胞的增殖、凋亡、耐药与损伤修复等。Nakamura等报道,在127例急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)临床标本中均存在FoxM1的过表达,并可调控Survivin和CyclineB等周期相关蛋白的表达;Gialmanidis等报道,FoxM1在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁正常肺组织,并与PTCH1和GLI1等HedgeHog信号通路蛋白相关,而后者与肿瘤的分级相关;Sun等研究证实,FoxM1的表达与肝癌分期、分级和大小等密切相关,可一定程度上提示患者的预后;Ahmad等研究发现,乳腺癌细胞中FoxM1的过表达,可使细胞的增殖速度明显提高,侵袭、转移能力明显增强;与此同时,FoxM1与肿瘤的药物敏感性密切相关,Gartel研究报道,不同肿瘤细胞株中加入噻唑类抗生素可通过抑制FoxM1的表达而加速细胞凋亡,提示FoxM1存在成为抗肿瘤药物作用靶点的可能。随着骨肉瘤临床与基础研究的进步,目前治疗以新辅助化疗支持下的保肢综合治疗为主,使患者的5年生存率有了明显的提高,并改善了患者的术后生活质量,尽管如此,我国骨肉瘤患者5年生存率为7.5%~77.6%,平均生存率为64.0%。近年来,骨肉瘤分子靶向治疗取得了一定的研究成果,出现了多个治疗靶点,但疗效尚不够理想,基础研究向临床应用的转化率还很低。因此,探索骨肉瘤发生发展中的重要相关分子,寻找诱导肿瘤细胞凋亡的新药物,对骨肉瘤的治疗具有重要意义。近年来研究表明,FoxM1在骨肉瘤中亦存在异常高表达现象,Wang等研究指出,在骨肉瘤细胞中FoxM1通过活化JNK1调节细胞周期;Grant等报道,在骨肉瘤细胞株中FoxM1可激活多个G2/M期和S期特异性基因的启动子,从而对骨肉瘤的细胞增殖起到调控作用。但FoxM1影响骨肉瘤发生与发展的分子机制仍未完全阐释。RNAi干扰技术是一项近年来逐渐成熟的生命科学技术,可特异性剔除或关闭特定基因的表达,被广泛应用于探索基因功能及恶性肿瘤的基因治疗等众多领域。本研究采用蛋白质印迹法检测到在两种骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1的表达,并利用siRNA干扰技术对FoxM1在细胞增殖与凋亡中的作用进行了初步探讨,发现实验组细胞转染特异性siRNA后,与转染阴性对照siRNA的对照组和空白对照组细胞相比,FoxM1在mRNA和蛋白水平表达显著下调,增殖率显著受到抑制,细胞凋亡明显增加。这与已报道的文献结果相吻合。其可能作用机制是FoxM1蛋白与PIK-1、Survivin和CDC25B等有丝分裂因子相互作用,阻断细胞周期,