xcr7-shrna基因表达载体的构建及对乳腺癌细胞mda-mb-定金细胞增殖、凋亡、周期的影响

xcr7-shrna基因表达载体的构建及对乳腺癌细胞mda-mb-定金细胞增殖、凋亡、周期的影响

1材料和方法1.1基因重组人cxcr7重庆医科大学中医系李少林教授介绍了女性乳腺癌细胞的mda-ml-435s以及牛血清（杭州四季青生物工程公司）、g418（gibco）、ri1640培养基（重庆医科大学基础研究所提供）、基因重组人cscl12（英国peprotection）、xcl7多克隆抗体（英国apam）、总伦提取试剂盒（上海华顺生物科技有限公司）、rt-pcr试剂盒、橡胶提取试剂盒、bamh、pst酶（大连宝生物）、李二醇（北京中国金桥）、c-任用（上海工程）、tune试剂盒（罗刀）、真实核粒pgpu6、gfp、纳米颗粒（上海吉玛）、cel显色剂（碧云天）、兔子抗人抗动人抗体（北京中国金桥）。1.2方法1.2.1cxcr7-shrna基因组织的构建构建针对CXCR7的shRNA真核表达载体,根据GenBank数据库提供的CXCR7基因(NM_020311),设计2组shRNA(分别命名为CXCR7-shRNA1、CX-CR7-shRNA2)。CXCR7-shRNA1靶序列:5′-GCATCTCTTC-GACTACTCAGA-3′,正义链:5′-CACCGCATCTCTTCGACTACT-CAGATTCAAGAGATCTGAGTAGTCGAAGAGATGCTTTTTTG-3′,反义链:5′-GATCCAAAAAAGCATCTCTTCGACTACTCAGATCT-CTTGAATCTGAGTAGTCGAAGAGATGC-3′;CXCR7-shRNA2靶序列:5′-GCTATGACACGCACTGCTACA-3′,正义链:5′-CACCGCT-ATGACACGCACTGCTACATTCAAGAGATGTAGCAGTGCGTGTC-ATAGCTTTTTTG-3′,反义链:5′-GATCCAAAAAAGCTATGACAC-GCACTGCTACATCTCTTGAATGTAGCAGTGCGTGTCATAGC-3′。pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建按照如下体系进行:10×T4LigationBuffer4μl,pGPU6/GFP/Neo(BbsⅠ+BamHⅠ)1μl,shRNA模板1μl,T4DNA连接酶0.5μl,ddH2O11.5μl,22℃1h。每个连接反应挑取6个菌落,接种到含50μg/mlKanamycin的LB培养集中。使用碱裂解法抽提质粒,所得质粒用BamHⅠ,PstⅠ分别酶切鉴定。1.2.2细胞转染及效率检测人MDA-MB-435s乳腺癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。按照Lipofectamineue4d22000试剂盒说明书进行转染操作。转染2d后更换为G418培养液(700μg/ml)筛选,对照细胞全部死亡时,降低G418浓度至300μg/ml维持筛选,获得稳定表达的细胞,荧光显微镜下观察转染效率。本研究共分4组:空白对照组、无关shRNA组、CXCR7-shRNA1组和CXCR7-shRNA2组。1.2.3ccg-gcag项目收获各组细胞,抽提细胞总RNA;根据GenBank中CXCR7基因序列设计引物,CXCR7上游:5′-TGGGTGGTCAGTCTCGT-3′,下游:5′-CCG-GCAGTAGGTCTCAT-3′,产物大小为294bp;同时以人GAPDH为内参,上游:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′下游:5′-TC-CACCACCCTGTTGCTGTA-3′,产物大小为450bp。反应条件:94℃变性5min,变性94℃30s,退火56℃30s,延伸72℃30s,循环30次,终末延伸72℃10min,其他步骤按说明书进行。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察并拍照。1.2.4转膜制备收集各组细胞,提取细胞总蛋白,BSA法进行蛋白定量,蛋白样品每孔上样量均为50μg总蛋白。电泳分离的蛋白条带转移至PVDF膜上,转膜时间为55min。室温封闭1h后,加入CXCR7mAb(1∶1000)、β-actin(1∶1000),4℃过夜;以TBST洗膜10min×3;加入山羊抗兔二抗(1∶5000),室温孵育1h后,以TBST洗10min×3。用化学发光法(ECL)曝光显影,冲洗胶片,用紫外分光光度计扫描条带灰度值,计算蛋白表达水平,β-actin作为内参照。1.2.5mtt法诱导表达将各组细胞制成单细胞悬液,按104/孔分别接种于96孔培养板,每孔加入100μl,各组细胞均加入CXCL12(200ng/ml)诱导;分别于24、48、72h和96h加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,继续孵育4h后,吸弃孔内培养液,加入DMSO150μl,置摇床上低速振荡10min,在酶联免疫检测仪测量各孔490nm处的光密度值[D(490)]。每组设5个复孔,取各组值的均数表示细胞的增殖情况。1.2.6流式细胞术检测细胞流式细胞回收各组细胞,制成单细胞悬液;75%冰乙醇固定,4℃过夜,重悬细胞,加入500μlPBS含50μg/ml溴化乙锭(PI),100μg/mlRNaseA,4℃避光染色30min,过滤后在流式细胞仪上进行检测。1.2.7凋亡指数检测将各组细胞制成细胞爬片,TUNEL法检测细胞凋亡,具体操作参照Roche公司试剂盒说明书进行。TUNEL检测细胞核染色呈蓝色的为正常细胞,呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞即为凋亡细胞。在每例爬片上,高倍镜(×200)下选5个视野对细胞进行计数,每一视野连续记数100个癌细胞,再计算出每100个细胞中凋亡的细胞数,即凋亡指数(AI)。取均值。凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%1.3统计分析数据用表示,采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1重组载体的鉴定使用碱裂解法抽提质粒,所得质粒用BamHⅠ,PstⅠ分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamHⅠ切开,而不能被PstⅠ切开。酶切结果表明,质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择2个克隆进行测序鉴定。2.2cxcr7基因表达抑制率分析RT-PCR结果显示,各样本均可见亮度均一的GAPDH条带,在空白对照组可见明显的CXCR7目的条带。与空白对照组相比,CXCR7-shRNA1组及CXCR7-shRNA2组CXCR7基因表达抑制率分别为(71±3)%和(68±5)%,差异具有统计学意义(P<0.05),表明两组shRNA真核表达载体均能有效抑制CXCR7mRNA表达。而无关shRNA组无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。2.3cxcr7蛋白表达CXCR7-shRNA1组、CXCR7-shRNA2组与空白对照组及无关shRNA组相比,细胞内CXCR7蛋白表达明显下降,其抑制率分别为(67±5)%、(65±2)%(P<0.05),表明CXCR7-shRNA真核表达载体构建成功,能有效沉默CXCR7蛋白的表达。与空白对照组比较,无关shRNA组蛋白表达无明显改变,两者差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。2.4mda-mb-400s细胞增殖MTT结果显示,在CXCL12诱导下,沉默CXCR7的表达以后,CXCR7-shRNA1组及CXCR7-shRNA2组MDA-MB-435s细胞增殖明显低于空白对照组,细胞生长明显受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05);无关shRNA组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。2.5mcs-400s细胞比例对mda-mb-400s细胞周期的影响流式细胞术检测结果示:CXCR7-shRNA1组及CXCR7-shRNA2组G1、S、G2期细胞比例与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明CXCR7表达的变化对MDA-MB-435s细胞周期无明显影响。无关shRNA组与空白对照组之间无显著差异(P>0.05)。见表1。2.6组患者比较TUNEL法检测结果示:空白对照组与无关shRNA转染组凋亡细胞均较少[(2.05±1.03)、(2.10±1.23)%],2组比较差异无统计学意义(P>0.05);而CXCR7-shRNA1组、CXCR7-shRNA2组[(37.11±3.96)、(38.95±3.87)%]细胞凋亡明显增多,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。3cxcr7在人乳腺癌和肺癌组织中的生物学效应趋化因子CXCL12及其受体(CXCR7;CXCR4)构成的信号通路与乳腺癌细胞的生长和器官特异性转移密切相关。肿瘤细胞可以表达CXCL12,刺激肿瘤间质细胞产生TNF-α,促进肿瘤细胞生长。乳腺癌中基质细胞大部分是由成纤维细胞构成。Orimo等研究表明,从人乳腺癌中分离的肿瘤相关性成纤维细胞较从同一患者正常乳腺部位分离的成纤维细胞能显著地促进乳腺肿瘤细胞的生长,原因是其分泌CXCL12与受体结合而刺激肿瘤细胞生长。历来认为,CXCL12只能与CXCR4这个唯一的受体结合来调控生物学功能。但最近研究发现CXCR7-新的趋化因子受体,它能够与CXCLI2结合发挥生物学作用,从而打破了CX-CL12只能与CXCR4受体结合这一传统观点,为趋化因子及其受体的研究开辟了新的空间。CXCR7能够促进乳腺肿瘤、肺肿瘤的生长以及转移;免疫组织化学证实在人乳腺癌及肺癌中CXCR7高表达,肿瘤血管内皮细胞也高表达CXCR7。在研究前列腺癌时发现,CXCR7能够促进肿瘤细胞的生长、抑制细胞凋亡、促进血管生成;CXCR7与Kaposi’s肉瘤的发生、发展也具有一定的联系。Meijer等发现CXCR7能够影响细胞的增殖、凋亡和趋化性。据以上研究结果我们初步推测,CXCR7在肿瘤发生中可能具有一定作用。为了探寻CXCR7在人乳腺癌细胞中的功能,我们首先构建了针对CXCR7短发夹状RNA序列的真核表达载体;将2个CXCR7shRNA载体转染MDA-MB-435s细胞,稳定筛选后,经RT-PCR、Westernblot分析,稳定表达的细胞中CXCR7mRNA及蛋白水平均降低,CXCR7的表达被有效抑制。趋化因子及其受体可以调节多种肿瘤细胞的增殖,包括卵巢癌、小细胞肺癌、前列腺癌等。Barbero等发现CXCL12与其受体结合可以活化ERK1/2和AKT信号通路诱导胶质瘤细胞的增殖。Hall等报道雌激素可诱导乳腺癌细胞CXCL12的分泌,从而促进雌激素受体α阳性的乳腺癌细胞增殖。本研究表明,有效沉默CXCR7的表达后,在CXCL12的诱导下,运用MTT方法检测人乳腺癌细胞的生长,发现细胞的增殖能力减弱;运用TUNEL法检测细胞凋亡,凋亡细胞增多;运用流式细胞术检测细胞周期,抑制CXCR7的表达对细胞周期无明显影响。目前,关于乳腺癌中CXCR7的生物学功能报道较少,CXCR7与其配体CXCL12结合后,通过何种信号途径影响癌细胞的生物学特性?其具体机制仍知之甚少。因此,我们希望通过研究CXCL12~CXCR7生物学轴,尝试着阐明肿瘤细胞内趋化因子网络,为肿瘤诊断和治疗提供一种新的选择。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的G蛋白偶联跨膜受体,通过与其配体结合而发挥作用,广泛参与细胞的生长、发育、分化、凋亡