酶的分离纯化

第四章酶的别离纯化及产品成型〔1〕酶的抽提〔2〕酶的别离纯化：沉淀别离、离心别离、膜过滤、层析别离、电泳别离〔3〕酶液的浓缩、结晶、枯燥、成型〔4〕酶纯化过程的纯度监测本章知识点：.一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。生物产物从原料〔培养液或细胞〕生产到产品的后处理技术〔别离纯化技术〕的开展，使低本钱、高收率地纯化目标产物成为现实。大多数酶的回收纯化过程本钱约占70%；医用酶的生产回收过程的本钱高达85%；基因工程表达产物的回收纯化过程本钱一般占85-90%以上；青霉素回收过程本钱约占50%；乙醇的回收过程本钱仅占14%。.二、别离纯化的一般流程原料液细胞别离〔离心、过滤〕细胞〔胞内产物〕清液〔胞外产物〕细胞破碎碎片别离粗别离纯化成品化线路2线路1.人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸锌盐析离子交换层析硫酸铵盐析铜螯合层析疏水层析凝胶电泳staehelin等人：硫酸铵盐析免疫亲和层析阳离子交换层析〔83.0%〕〔62.7%〕〔96.2%〕〔46.0%〕〔78.3%〕〔88.9%〕共六步，总收率仅为16%仅三步，总收率达81.0%.在实践工作中选择方法时:首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯洁，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降,酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。.三、酶别离纯化的根本原那么〔一〕酶别离纯化包括三个根本环节抽提纯化精制〔二〕酶别离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的始终。..第一节从发酵液制取酶提取液〔酶溶液的制备〕一、发酵液的预处理目的：降低粘度，便于固液别离方法：〔1〕加热：适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。〔2〕加凝聚剂或絮凝剂〔3〕调pH值二、固液别离方法：〔1〕离心别离；〔2〕过滤；〔3〕双水相萃取.三、细胞破碎机械破碎法物理破碎法化学破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、Tween等外表活性剂酶促破碎法捣碎法：捣碎机研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等匀浆法：匀浆器温度差破碎法：冻融交替法压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法超声波破碎法自溶法加酶处理G+菌：溶菌酶G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶霉菌：几丁质酶.四、抽提〔一〕抽提方法指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂〔二〕抽提过程中的本卷须知1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待抽提酶的等电点。2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、抽提液体积〔用量〕

抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。4、为提高酶的稳定性，可以参加适量的保护剂。.分离依据的性质分离方法根据分大小、轻重离心分离、凝胶过滤、膜分离根据溶解度大小盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、选择性沉淀、等电点沉淀根据电学性质离子交换层析、电泳分离根据稳定性差异选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法根据亲和作用亲和层析、亲和电泳酶别离纯化方法：现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。.第三节酶的沉淀别离盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法一、盐析沉淀法1、原理：2、硫酸铵盐析的优点优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小；②价廉，廉价；③可保护酶。缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。.3、盐析操作〔1〕硫酸铵的饱和度×100%（NH4）2SO4的饱和度（%）=实际浓度饱和浓度0.4S=40%〔饱和度〕.〔2〕调整盐浓度的方法加饱和〔NH4〕2SO4溶液：VV0（S2-S1）1-S2=V0—原来溶液的体积V—所需加入饱和硫酸铵的体积S1—原来溶液的硫酸铵饱和度S2—所需达到的硫酸铵饱和度例：将2升0.2S的硫酸铵溶液提升至0.5S，需加饱和硫酸铵多少升？溶液体积增加多少倍？.加固体〔NH4〕2SO4：WB（S2-S1）1－AS2=W—将1L饱和度为S1的溶液提高到S2所要添加的固体硫酸铵克数；A、B—与温度有关的经验常数例：某酶制剂厂生产15吨蛋白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析,要求硫酸铵的饱和度到达40%，计算需要参加固体硫酸铵多少kg?〔25℃〕经验常数0℃10℃20℃25℃30℃A0.2710.2810.2900.2940.298B（g/L）514.72525.05536.34541.24545.88（mol/L）3.093.974.064.104.133680Kg.(25℃).当溶液体积不大，要到达的盐浓度不高，可以参加饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要到达的盐浓度又较高，此时参加固体硫酸铵较好。4、为了得到较好的盐析效果，应控制以下因素〔1〕不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实验确定。〔2〕加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。〔3〕pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。〔5〕脱盐：超滤、透析或层析。〔4〕蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0%为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。..〔二〕等电点沉淀1、原理2、实际操作与其他方法一起使用〔盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀〕。单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。3、注意加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。.〔三〕有机溶剂沉淀法1、作用原理去水膜；降低介电常数、破坏氢键。2、注意低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快别离。.〔四〕复合物沉淀法1、原理2、常用的复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。PAA+酶PAA-酶PAA-酶PAA+酶

PAA+酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAApH6以上.〔五〕选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶那么保持可溶状态。2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。.借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行别离、提纯或浓缩的新型别离技术。第三节膜过滤技术在酶别离纯化中的应用膜别离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有开展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液.一、膜别离的类型1、按推动力不同可分为：〔1〕扩散膜别离：渗透、透析〔2〕压力差膜别离：微滤、超滤、纳滤、反渗透〔3〕电位差膜别离：电渗析2、按膜孔径或截留物质的大小：微滤——超滤——纳滤、电渗析、透析——反渗透膜孔径大小.病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水灰尘细菌病毒生物大分子生物小分子盐类水膜微滤〔MF〕超滤〔UF〕纳滤〔MF〕反渗透滤〔RO〕灰尘细菌〔0.2-2um〕〔10-200nm〕〔＜2nm〕〔2-10nm〕.各种膜别离法的原理和应用范围膜分离法截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质应用举例微滤（MF）0.2~2um灰尘、细菌微孔滤膜除菌，回收菌超滤（UF）10nm~200nm生物大分子及以上超滤膜蛋白质、多肽和多糖的回收和浓缩纳滤（NF）2nm~10nm生物小分子及以上纳滤膜脱盐、浓缩反渗透（RO）<2nm盐类及以上反渗透膜盐、氨基酸、糖的浓缩、淡水制造.〔一〕微滤(MF)又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜别离技术。〔1〕截留颗粒直径：0.2~2um。〔2〕操作压力：低于0.1MPa。〔3〕应用：实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵液中的细胞。无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药物和营养物质的过滤除菌等二、酶别离纯化中几种常见的膜别离技术.〔二〕超滤(UF)可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。〔1〕截留颗粒直径：10~200nm。〔2〕操作压力：0.1~0.7MPa。〔3〕应用：一是别离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。.〔三〕反渗透(RO)在压力作用下，溶剂〔通常是水〕透过膜，而溶质被阻挡于膜壁外。〔1〕截留颗粒直径：小于2nm。〔2〕操作压力：1~8MPa。〔3〕应用：主要用于别离各种离子和小分子物质。在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。溶质水水膜溶质水水膜渗透反渗透.〔四〕电渗析在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而到达别离的目的。酶液膜膜+-+-应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备等.透析袋酶溶液蒸馏水应用：在生物别离方面，主要用于生物大分子溶液的脱盐。由于透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过通量很小，不适于大规模生物别离过程，而在实验室中应用较多。〔五〕透析盐类水膜透析水膜渗透.三、膜别离技术的根本流程渗出液膜组件料液罐浓缩液（回流液）泵.中空纤维超滤器中空纤维膜别离装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成．具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维外表积大，流量大、阻留溶质的浓度范围(4％一20％左右)如右图。四、生产中常用的膜别离装置.中空纤维超滤膜组件.清洗液清洗液出口渗出液渗出液（c）.......五、膜及膜的使用性能〔一〕、膜的结构和制膜材料膜表层：孔径各异，厚度为0.1~5um基层：起支持作用，厚度为50~250um制膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚酰胺等〔二〕、膜的使用性能〔1〕透水率〔透水通量、流率〕；〔2〕截留率；〔3〕截留物相对分子质量.生物别离过程常用的膜别离技术为超滤、微滤和反渗透。为实现高效率的膜别离操作，对膜材料有如下要求：(1)起过滤作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小；(2)膜材料为惰性，不吸附溶质(蛋白质、细胞等)，从而使膜不易污染，膜孔不易堵塞；(3)适用的pH和温度范围广，耐高温火茵，耐酸碱清洗剂，稳定性高，使用寿命长；(4)容易通过清洗恢复透过性能；(5)满足实现别离目的的各种要求，如对菌体细胞的截留、对生物大分子的通透性或截留作用等。目前市售膜的种类很多，主要有天然高分子、合成高分子和无机材料。下面简要介绍制造超滤、微滤和反渗透膜的各种膜材料。膜材料.1.天然高分子材料主要是纤维素的衍生物，有醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤维素等。其中醋酸纤维膜的截盐能力强，常用作反渗透膜、也可用作微滤膜和超滤膜。醋酸纤维膜使用最高温度和pH范围有限，一般使用温度低于45～50℃，pH3～8。再生纤维素可制造透析膜和微滤膜。2.合成高分子材料市售膜的大局部为合成高分子膜，种类很多，主要有聚砜、聚丙烯晴、聚酰亚胺、聚酰胺、聚烯类和含氟聚合物等。其中聚砜是最常用的膜材料之一，主要用于制造超滤脂。聚砜膜的特点是耐高温(一般为70～80℃，有些可高达125度)，适用pH范围广(pH1～13)，耐氯能力强，可调节孔径范围宽(1～20nm)。但聚砜膜耐压能力较低，一般平板膜的操作力极限为0.5～1.0MPa。聚酰胺膜的耐压能力较高，对温度和pH都有很好的稳定性，使用寿命较长，常用于反渗透。.3无机材料主要有陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。目前实用化的无机膜主要有孔径0.1μm以上的微滤膜和截留相对分子质量l0kD以上的超滤膜，其中以陶瓷材料的微滤膜最为常用。多孔陶瓷膜主要利用氧化铝、硅胶、氧化锆和钛等陶瓷微粒烧结而成，膜厚方向不对称。无机膜的特点是机械强度高，耐高温、耐化学试剂和耐有机溶剂，但缺点是不易加工，造价较高。另一类无机微滤膜为动态膜(dynamicmembrane)，是将含水金属氧化物(如氧化锆)等胶体微粒或聚丙烯酸等沉积在陶瓷管等多孔介质外表形成的膜，其中沉积层起筛分作用。动态膜的特点是透过通量大，通过改变pH值容易形成或除去沉积层，因此清洗比较容易，但缺点是稳定性较差。.1、假设除去酶溶液中的盐分，可采用下面哪种别离方式？〔〕A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透2、假设要别离除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪种别离方式？〔〕A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透练习：.第四节离心技术在酶别离纯化中的应用离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。〔一〕根本原理离心力：Fc=mac=mω2r

rminrmeanrmax轴心离心管式中：Fc—离心力；m—为物质质量(g)；ac—为离心加速度(m/s2)；r—离心管中受力粒子到离心机轴心的垂直距.相对离心力：=11.18×10-6n2r〔g〕〔r取厘米，g为980厘米/秒2〕工业上称相对离心力为离心别离因素，r取米，那么：RCF=1900n2r〔g〕.〔二〕离心机分类低速离心机：＜8000r/min高速离心机：8000~25000r/min超速离心机：＞100000r/min冷冻系统、离心管帽冷冻系统、离心管帽、真空系统.料液轻相重相工业用碟片式离心机.〔三〕离心方法1、差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降的颗粒先后别离的方法。2、密度梯度离心在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的外表，经过离心，不同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成假设干条不连续的区带。3、等密度梯度离心当欲别离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。.〔四〕离心沉降速度和沉降系数沉降速度〔v〕：离心管中的粒子在离心力场作用下，向垂直于转轴方向移动的速度。v

=drdt=S·ω2rS=dr/dtω2rS为沉降系数，单位：秒许多大分子和超分子复合物〔如核糖体等〕的沉降系数，都在10-13秒这个数量级，将定为1S.〔五〕离心时间离心时间:1dt=

ω2Sdrr·t2–t1=1ω2S（lnr2-lnr1）积分得：根据所用的离心机，确定了沉降开始的离心半径r1和预定终止的r2，又确定了离心时的转速，对某一具体的颗粒，其沉降系数S也是定值，就可计算出离心所需时间〔t2-t1〕.作业题：1、在25℃下，将800L含硫酸铵为0.2S的溶液提高到0.5S，需要加饱和硫酸铵溶液多少升？或者加固体硫酸铵多少公斤？2、实验室台式离心机转速为4000r/min，离心半径5cm，RCF为多少？工业离心机同样转速，离心半径为0.3m，离心别离因素是多少？.第六节层析(色谱)技术在酶别离纯化中的应用.一、色谱别离法色谱法是1905年俄国植物学家茨维特创造的。他将植物色素的石油醚提取液倒入一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出现别离，在管内显示出不同的色带，色谱一词由此得名。碳酸钙〔固定相〕石油醚〔流动相〕色谱柱.二、色谱法分类1、根据流动相状态不同分液相色谱气相色谱常压液相色谱

√高压液相色谱2、根据分离介质不同分柱色谱√纸色谱薄层色谱毛细管色谱.3、根据别离原理不同分吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析√√√.三、层析别离的原理混合液中各组分的理化性质〔分子大小、吸附力、亲和力、带电等〕不同，固定相对不同组分的作用力(方式,大小等)不同，随着流动相相对于固定相运动,各组分在固定相上移动速度不同,从而彼此别离开来。.四、根本操作过程(柱层析)层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样〔洗涤和〕洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线〔柱再生〕下一轮上样.1、层析柱：材料：玻璃或有机玻璃、钢管。高径比〔H/D〕：100~150:1~202、固定相材料准备

筛选颗粒大小一致的组分→浸泡吸胀→淘洗去小颗粒吸附剂：筛选→高温处理活化或酸碱处理去金属离子。离子交换剂：HCl或NaOH交换处理，离子交换树脂用2~3倍于树脂体积的2mol/L，离子交换纤维素用0.5mol/L酸、碱处理。.3、装柱与平衡

垂直固定柱，然后干法或湿法装柱，再用2~3倍体积的上样缓冲液过柱，使柱床的离子强度与上样液一致，即所谓平衡。4、上样〔加样〕将样品细心加到柱床顶面，切勿冲动床面。5、〔洗涤〕洗脱、收集和分析洗涤是亲和层析的独特步骤，是用上样缓冲液过柱，将未被亲和吸附剂吸附的杂质淋洗出柱床的操作。.五、几种层析别离方法〔一〕吸附层析利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分别离的方法。1、原理2、吸附剂的种类和特点〔1〕种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。.〔2〕特点：①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。②有些吸附剂使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强别离效果。③上样时低pH值和低离子强度，半小时后提高pH值和离子强度洗脱。3、吸附的三个根本环节：加样、吸附、洗涤或洗脱。.4、洗脱方法：〔1〕溶剂洗脱法：〔2〕置换洗脱法：〔3〕前缘洗脱法：.〔二〕离子交换层析1、原理利用离子交换剂上的可解离基团〔活性基团〕对各种离子亲和力不同而到达别离目的的一种别离方法。2、离子交换剂〔1〕根据母体不同可分为离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活离子交换纤维素：最广泛的一类离子交换凝胶：不耐高流速洗脱.根据活性基团性质不同可分为阳离子交换剂：能吸附带“+〞的离子或酶-CM-〔羧甲基〕、-PO32-〔磷酸基〕、-SO3-〔磺酸基〕阴离子交换剂：能吸附带“-〞的离子或酶-DEAE〔二乙基氨基乙基〕、-TEAE〔三乙基氨基乙基〕3、离子交换反响蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂。.4、操作要点〔1〕装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。〔2〕加样、平衡：1%~5%上样量。〔3〕洗脱、收集：梯级洗脱〔分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度〕、梯度洗脱〔连续改变pH或盐离子强度〕。〔4〕再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。..练习1、下面哪一种不能作为离子交换剂用于别离纯化酶？〔〕A、DEAE-SephadexB、CM-纤维素C、TEAE-SepharoseD、SephadexG502、某酶的等电点为6.8，假设采用DEAE-纤维素进行离子交换别离，可选择下面哪种pH的缓冲液上柱？〔〕A、pH为5.0的缓冲液B、pH为6.8的缓冲液C、pH为8.0的缓冲液D、都不行.〔三)凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography1、原理利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同到达别离的目的。2、常用的凝胶种类（1）葡聚糖凝胶

SephadexG-X

X—表示每克干胶的吸水值的10倍吸水值越大，分子量范围越宽.〔2〕琼脂糖糖凝胶Sepharose2B、4B、6B2B、4B、6B表示琼脂糖含量为2%、4%、6%，浓度越高，凝胶网眼孔径越小，分布的大分子相对分子质量越小，范围越窄。〔3〕聚丙烯酰胺糖凝胶Bio-GelP-2、4、6、…….、200、300，共10种型号。P后的数字表示别离的最大相对分子质量〔×103〕。..3、操作要点〔1〕、装柱前要吸胀和抽气。常温吸胀需较长时间，可加热溶胀。〔2〕、加样量不超过3%。〔3〕、洗脱液应与平衡时的溶液一致。〔4〕、无须经过再生处理。〔5〕、长期不用时，可加0.02%的NaN3保存。..4、凝胶层析测定蛋白质〔酶〕的相对分子质量不同分子之间的别离，是它们在内水和外水之间的一种分配行为，流出柱的先后，用分配系数Ka作定量描述：Ka=〔Ve-Vo〕/ViVe——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和当Ka=0时，Ve=Vo，全排出的大分子当Ka=1时，Ve=Vo+Vi，是全受阻的小分子或无机离子Ka=0~1时，其他大小介于两者之间的分子.Ve——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和Ka值最小的，最先流出；Ka值最大的，最后流出。同一个凝胶床，内水体积和外水体积〔Vo和Vi〕为定值，因而洗脱体积〔Ve〕小的，就是相对分子质量大的。Ka

=Ve-VoVi.Ve

=-K2lgMr+K1Mr——相对分子质量蛋白质分子量与凝胶层析洗脱体积的关系VelgMr····用一组相对分子质量的蛋白质进行实验，作出上图，然后对未知相对分子质量的蛋白质〔酶〕在同一凝胶柱上实验，测得Ve，就可以查标准曲线算出它的相对分子质量。.练习下面哪一种不能用于凝胶过滤别离纯化酶？〔〕A、SephadexB、PEGC、SepharoseD、PAG.〔四)亲和层析1、原理

生物分子对间的专一而又可逆的结合力，称为亲和力，利用这种亲和专一性的特点，而制备专门的亲和吸附剂，用其进行蛋白质等生物分子的层析纯化，就是亲和层析，效率特别高。2、亲和吸附剂由母体与配基偶联而成。配基：作为固定相的分子对的一方。母体：又称载体，如各种凝胶、纤维素均是惰性物，须先活化后再与配基反响。.3、操作要点(1)要先洗涤后洗脱,用含有与亲和吸附剂相同的高浓度配基或另一种配基洗脱。〔2〕柱床要再生10倍于柱床体积的0.1mol/LNaCl-0.1mol/LTris-HCl洗至PH8.5,改用0.5mol/LNaCl-0.1mol/LHAC洗至pH4.5,然后用纯水洗至中性..4、亲和层析方法〔1〕共价亲和层析〔2〕疏水层析〔3〕金属离子亲和层析〔4〕免疫亲和层析〔5〕染料亲和层析〔6〕凝集素亲和层析.吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析固定相支持物物理吸附剂，如活性氧化铝磷酸钙胶体等离子交换凝胶离子交换纤维素离子交换树脂葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶（凝胶网孔内水为固定相）用琼脂糖或纤维素为载体共价结合适当的配基而成亲和吸附剂操作步骤特殊点无纤维素和凝胶类交换剂装柱时先抽气，柱床要再生后再上样湿凝胶抽气后湿法装柱上样后先洗涤除杂质然后洗脱，柱床要再生洗脱特点洗脱液离子强度比样品液高常用pH梯度或盐浓度梯度洗脱用样品和平衡缓冲液洗脱洗脱液含酶的配基或其他物质应用酶分离纯化成本较低离子交换纤维素洗脱条件较温和，酶分离纯化多用广泛用于酶分离纯化、脱盐、测定相对分子质量酶纯化效率高，但制备亲和吸附剂较麻烦，贵.第六节电泳技术在酶别离纯化中的应用.电泳的定义带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行别离的一类实验技术。电泳开展:电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种别离技术却是在1937年由瑞典科学家TiseliusA首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳〞别离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出奉献，1948年他被授予诺贝尔奖。.带电粒子在电场中迁移的速度：A、α—常数r—粒子的半径Q—粒子的外表电荷量η—介质的粘度E—电场强度μ—介质的离子强度一、电泳的根本原理.此式说明：影响电泳时带电粒子迁移速度的因素，包括：〔1〕电场强度〔电压〕〔2〕带电粒子外表电荷〔3〕带电粒子大小〔4〕介质的粘度〔5〕溶液的离子强度〔6〕电渗的影响，公式中没有反映，主要在纸电泳时表现较明显。.在一定的电泳条件下，E〔V〕、η、μ为定值，对于酶等两性大分子来说，电泳时的迁移速度，主要取决于分子的外表电荷多少和分子大小，因此，不同的分子可以由Q和r不同而彼此别离。蛋白质〔酶〕的电荷性质和电荷量，取决于它们的PI与溶液的pH值的关系。.1、聚丙烯酰胺凝胶〔PAG〕PAG由丙烯酰胺〔arc，单体〕和甲叉双丙烯酰胺〔bis，双体，交联剂〕在催化剂作用下聚合而成。arc浓度：凝胶的孔径大小arc和bis的比例：凝胶的强度催化剂用量：聚合时间二、聚丙烯酰胺凝胶电泳〔PAGE〕.2、PAGE的应用类型常规PAGE浓度梯度PAGESDS不连续PAGE〔用于一般分析别离纯化〕连续PAGE〔同上〕〔用于测定Pr相对分子质量和别离纯化〕〔用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳〕.3、不连续PAGE的特性和别离Pr的效应〔1〕三个不连续凝胶浓度不连续；pH值不连续；缓冲液不连续。〔2〕三种效应浓缩效应；电荷效应；分子筛效应。..4、浓度梯度PAGE

配制4%和30%的别离胶，在梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶，其网眼孔径从上至下越来越小，电泳时，不同Pr主要依r大小而别离，即分子筛效应>电荷效应,可用于测定蛋白质的相对分子质量。.5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠CH3〔CH2〕11SO4Na2在配制凝胶时参加SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体〔亚基〕，SDS分子就将每个单体分子外表覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的外表电荷根本相同，故可因分子长轴大小〔即亚基分子大小〕差异而别离，换言之，亚基的大小是彼此别离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。.6、PAGE的一般操作程序配制各种制胶的贮存液准备制胶模具配制铸胶混合液灌注胶液并聚合成凝胶上槽点样通电电泳取出凝胶Pr染色漂洗显带记录计算绘制电泳图谱...SDS测定蛋白质〔亚基〕的相对分子质量〔Mr〕与它们的电泳迁移率〔U〕之间，存在如下关系：

lgMr=lgK-bU

用lgMr对U作图，只要实验测得，就可用标准曲线法求得未知蛋白质〔亚基〕的相对分子质量。实际工作中，常用相对迁移率〔用mR表示〕代替U作图。mR=蛋白质移动的距离溴酚蓝移动的距离.三、等电点聚焦电泳〔IEFisoelectricfocusing〕1、等电点聚焦电泳别离Pr原理等电点聚焦电泳是在电泳介质中参加两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此别离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。2、两性离子载体

各组分的pI值十分接近，在电泳中可以形成连续的pH梯度，常用的商品名为Ampholine，规格有pH3.5~9.0和精细分级的pH3.5~5、5~9、9~11的多种商品可供不同的要求使用。.第五节酶液的浓缩、结晶、枯燥与成型一、稀酶液的浓缩浓缩是从稀溶液中除去一局部溶剂〔水〕，使其变成浓缩液的工艺。酶液浓缩的方法很多：如沉淀，低温真空蒸发、超滤等。二、结晶1、结晶的一般原理不饱和溶液饱和溶液过饱和溶液析出沉淀（快）析出结晶（慢）（无排列排队机会）.2、结晶“三步曲〞第一步：形成过饱和溶液——稍微越过饱和状态，处于介稳态，浓缩、降温〔少有升温〕、调节pH至pI，可使溶液趋于过饱和。第二步：形成晶核——过饱和溶液在一定条件下可形成极微小的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称为晶核。振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形成晶核，有时可投入少量“晶种〞微粒。第三步：晶体生长——溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐步长大，控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶体溶解，溶质到大晶体周围集结生长。.