天然药物实验指导

实验指导《中药化学》实验室注意事项中药化学实验课具有实验周期长、使用有机溶剂品种多，用量较大等特点，所用的药品多数是挥发性、易燃、有腐蚀性、刺激性、实验操作经常在加温，减压下进行，需要使用各种热源和电器，再加上实验室较为拥挤，若操作不慎，易引起着火、触电、中毒、爆炸等事故，为确保实验安全顺利进行，特作如下要求。一、实验前必须预习实验内容，了解实验原理和操作程序，检查仪器是否完整，装置是否正确，检查合格后方可开始实验。二、实验室内要保持严肃、安静，不得大声说话打闹，室内严禁吸烟，实验进行时不行擅自离开，必要时委托专人看管。三、未经教师允许不得擅自使用明火，需使用明火时，实验台周围不得放置易燃有机溶剂，如发生火情应保持镇静，立即报告指导教师同时切断火源，移走易燃品，用湿布闷盖或用灭火器进行灭火，切勿轻易用水，以免扩大火势。四、实验时要做到整齐、清洁、用过的仪器要及时清洗并收入仪器柜内，保持水、仪器、桌面、地面四洁。五、回流、蒸馏有机溶剂时，注意检查冷凝水是否通畅，装置不得密闭，接收有机溶剂时不得使用广口仪器，溶剂瓶不得敝口存放。在进行减压操作时，必须使用安全瓶，弄清操作程序，以免造成回水等事故。六、使用挥发性试剂或喷显色剂时，应在窗口或通风橱内操作，不慎溅在桌面上的化学药品必须立即清除。身体直接接触化学物品后应及时用肥皂及大量水冲洗，如碱性试剂可用l%HAc溶液冲洗，酸性试剂可用3%NaHC03溶液冲洗。不要用酒精、丙酮等洗涤皮肤上的有机物，以免增加皮肤对有毒物质的吸收，眼睛内溅入化学试剂后，应立即用大量水冲洗，及时到校医室就诊。七、 使用电器设备（如水浴锅、紫外灯、旋转蒸发仪、循环水泵等）一定要按操作规程进行，不得在烘箱内干燥带有易燃性有机溶剂的仪器或物品，仪器发生故障时及时报告指导教师，不得擅自拆卸。八、 每次实验结果后的产品，应妥善包装好，贴好标签，写明级别、产率等，放入干燥器内保存，不得随意丢失。九、 实验结束后，值日生应做好实验室清洁卫生工作，整理好公共仪器、药品，检查水、电、门窗，经教师检查后方可离去。实验一粉防己中粉防己生物碱的提取、分离和鉴定粉防己为防己科千金藤属植物粉防己的干燥块根。又名汉防己、倒地拱、百木香。具有利水消肿，祛风止痛的功效，用于治疗神经痛、关节炎等症。粉防己的有效成分是双苄基异喹啉型生物碱，总碱含量约1~2%，其中主要是粉防己碱、去甲粉防己碱及轮环藤酚碱。一、实验目的要求1、掌握总生物碱的提取及脂溶性生物碱和水溶性生物碱的分离、纯化方法

2、掌握脂溶性和水溶性生物碱的薄层色谱鉴定方法3、熟悉生物碱衍生物的制备方法二、实验原理利用乙醇提取总生物碱，回收乙醇得总生物碱的浸膏，利用脂溶性生物碱在酸性条件下成盐后，溶于水不溶于极性小的有机溶剂；在碱性条件下成游离生物碱，溶于极性小的有机溶剂不溶于水的特点，反复处理，藉此使脂溶性的粉防己甲及粉防己乙素与水溶性的轮环藤酚碱分开，并去除部分杂质。R=HCH3R=CH3粉防己碱R=HCH3R=CH3粉防己碱去甲粉防己碱三、实验方法1、粉防己总碱的提取称取粉防己粗粉100g，置于500ml圆底烧瓶中，加80%〜95%乙醇浸没药材（约需300ml），水浴加热回流1~2小时，过滤，滤液置1000ml三角烧瓶中。药渣再加乙醇浸没，如上法再提取2次。合并3次乙醇提取液，如有絮状物析出，再过滤1次，澄清溶液浓缩至糖浆状。2、亲脂性生物碱和亲水性生物碱的分离 将糖浆状总提取物置三角烧瓶中，逐渐加放100ml左右1%盐酸液，同时充分搅拌，促使生物碱溶解，不溶物则呈树脂状析出。静置，滤出上清液，用1%盐酸少量多次洗涤不溶物，直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱为止。合并洗液和酸性溶液，移置于分液漏斗中用氯仿洗3次，每次取用酸水液的1/3量。氯仿洗液合并，用1%盐酸洗1~2次。将洗涤氯仿液的酸液和总酸水液合并，留取8ml作沉淀反应，其余酸液移入500ml的三角烧瓶中，滴加浓氨水中和至pH9~10,此时亲脂性的叔胺碱游离出来。如有发热现象，应设法冷却，加氯仿50ml，再移置500ml分液漏斗中，振摇萃取，分取氯仿层，上层碱水液再以新鲜氯仿萃取数次，每次用氯仿50ml，直至氯仿抽提液生物碱反应微弱时为止（试验时取氯仿溶液置表面皿上待溶剂挥发，残留物中加稀盐酸2滴使溶解，再加生物碱沉淀试纸试之，或做薄层板点滴反应）合并氯仿溶液并置分液漏斗中，先以1%NaOH液洗2次后，再用水洗耳恭听2~3次，碱水洗液和氨性碱水液合并，留待分离水溶性生物碱。氯仿液用无水硫酸钠脱水，回收氯仿至干，抽松，加丙酮约30ml热溶，必要时抽滤，丙酮液冷后，析晶，抽滤，得脂溶性生物碱（粉防己甲素和乙素的混合物）。3、粉防己甲素和粉防己乙素的分离 称取粗总碱，置于25ml三角烧瓶中，加5~6倍苯冷浸，室温放置30min后，抽滤，苯不溶物主要含乙素，可用95%乙醇溶解，加少量活性炭回流脱色，乙醇液浓缩，析晶，抽滤，得粉防己乙素。苯液回收至干，加20倍量95%乙醇，适量活性炭回流加热30min,抽滤，乙醇液放置，析晶，抽滤，得粉防己甲素，干燥，称重,用丙酮（1：40，W/V）重结晶，（热溶，抽滤）得粉防己甲素精制品，作TLC检查。4、季胺生物碱——轮环藤酚碱的分离纯化 将碱水液用NHfl固体中和至pH7,置分液漏斗中，用正丁醇提取数次，直至碱水液生物碱反应微弱为止（取数滴碱水液于试管中，用稀HCl酸化后，再加生物碱沉淀试剂试之，或作薄层板点滴反应）。正丁醇液减压浓缩至干，用95%乙醇溶解，滤除不溶物，乙醇液浓缩至小体积，放置，析晶。反复数次，可得轮环藤酚碱精制品，作TLC检查。5、 粉防己生物碱的鉴定（1）生物碱沉淀反应：取粉防己酸水液分别置小试管中，每份1ml，分别滴加下列各试剂2~3滴，观察有无沉淀及颜色变化。A、 碘化铋钾试剂；B、 硅钨酸；C、 苦味酸试剂（先将酸水液调至中性，再滴加试剂）（2）薄层色谱：A、 粉防己生物碱：吸附剂：硅胶-CMC-Na板展开剂：氯仿-乙醇（10：1）氨饱和；甲苯-丙酮-甲醇（4：5：1）氨饱和对照品：粉防己甲素乙醇液粉防己乙素乙醇液显色剂：改良碘化铋钾试剂B、 轮环藤酚碱：吸附剂：硅胶-CMC-Na板展开剂：甲醇-氨水（7：3）对照品：轮环藤酚碱水液显色剂：改良碘化铋钾试剂6、衍生物的制备（1）苦味酸盐：取粉防己碱200mg溶于2ml丙酮中，滴加苦味酸的饱和水溶液，即析出黄色沉淀，滴加试剂至沉淀完全，抽滤，收集沉淀，依次以少量水、乙醇、乙醚洗涤，再经乙醇重结晶，可得苦味酸盐，mp241〜246°C。（2）粉防己甲素二碘甲烷盐（汉肌松）的制备：取粉防己甲素200mg，加甲醇10ml溶解，加碘甲烷1ml，回流加热15min,蒸去甲醇，残留物以水或乙醇重结晶，得白色鳞片状结晶，即粉防己甲素二碘甲烷盐（汉肌松），mp216.5C。四、操作要点1、 提取总碱时，回收乙醇至稀浸膏即可。过干时，当加入1%盐酸水后，会结成胶状团块，影响提取效果。2、 滴加浓氨水中和至pH9〜10时，若有发热现象，应设法冷却，以免加入的氯仿挥发。3、 去甲粉防己碱虽然也有酚羟基，但不溶于一般浓度的NaOH液，故称之为隐性酚羟基，用2%NaOH萃提时，仍留在CHCl3液中。4、 纯化时，若溶剂量太大，不易析晶，可再蒸去一些溶剂后，放置，以利结晶析出。五、思考题1、 提取总生物碱的常用方法有哪几种？各有何缺点？2、 粉防己碱和去甲粉防己碱在结构上有哪些异同点？实验中如何利用它们的共性和个性？3、 什么叫生物碱的假阳性反应？能消除吗？4、 萃取操作的好坏对实验结果有什么影响？怎样防止产生乳化？怎样消除乳化？为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置？实验二大黄中大黄素的提取、分离和鉴定

大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄，药用大黄和唐古物大黄的根茎。具有泻下、健

胃、抗菌、清热、解毒、收敛和利胆等作用。此外，还有止血、降低血清胆甾醇的作用。大黄中含有多种羟基蒽醌类化合物，其中有较少量的游离羟基蒽醌（约为大黄的0.5%左右），它们在植物中主要以苷的形式存在。一、 实验目的和要求1、 掌握PH梯度萃取法的原理和操作技术

2、 学习用硅胶柱色谱法分离精制大黄素3、学习羟基蒽醌类化合物的鉴定方法、实验原理根据大黄中蒽醌类成分酸性强弱不同的特性，以乙醚提取脂溶性成分后，利用碱度递增的碱水液，自乙醚提取液中萃取酸度递减的游离蒽醌类成分，本实验主要分离甘I•廿•于其大黄素。1，8-二羟基蒽醌衍生物1，8-二羟基蒽醌衍生物HCH3大黄酚AOHCH3大黄素BOCH3CH3大黄素甲醚CHCH2OH芦荟大黄素DHCOOH大黄酸ER1R酸性：E>B>D>C、A极性：E>D>B>C>A三、 实验方法1、酸水解取大黄粉log,加20%硫酸水溶液100ml,在水浴上加热3~4小时，抽滤，滤饼水洗后于70°C左右干燥。2、总羟基蔥醌苷元的提取滤饼经干燥后，置索氏提取器中，加入乙醚150ml,回流提取3~4小时，得乙醚提取液。乙醚提取液经薄层色谱检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶-CMC-Na，展开剂为石油醚（沸程60〜90C）-乙酸乙酯（7：3），近水平或直立展开，在可见光下可看到4个斑点，Rf为0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余3个斑点，依Rf值由大到小分别为大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。3、 pH梯度萃取分离（1）置乙醚提取液于250ml分液漏斗中，以2.5%碳酸氢钠水溶液120ml分3次萃取，乙醚层经薄层色谱检查（薄层条件同上），知大黄酸己除去。合并3次碳酸氢钠萃取液酸化，可得大黄酸沉淀。（2）经2.5%碳酸氢钠水溶液萃取后的乙醚层，以2.5%碳酸钠水溶液120ml分3次萃取,乙醚层经薄层色谱检查，知大黄素己除去。合并3次碳酸钠萃取液，酸化，主要得大黄素沉淀，另含有少量大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素等。水洗沉淀物至洗出液呈中性低温干燥后作为柱色谱样品。经2.5%碳酸钠水溶液萃取后的乙醚层，继续用2.5%碳酸钠水溶液120ml分4次萃取，乙醚层经薄层色谱检查，知芦荟大黄素己除去。合并4次碳酸钠萃取液，酸化，得芦荟大黄素沉淀。经2.5%碳酸钠水溶液萃取后的乙醚层，再以0.5%氢氧化钠水溶液100ml分4次萃取至碱水层无色为止，合并氢氧化钠萃取液，酸化得沉淀，为大黄酚和大黄素甲醚混合物。4、 硅胶柱色谱分离精制大黄素装柱：取100~200目的硅胶约10g，按干法装柱加样：将样品溶解于5ml石油醚(沸程60〜90°C)-乙酸乙酯(7：3)中，用吸管吸取样品溶液于色谱柱柱床顶端。洗脱：用石油醚(沸程60~90C)-乙酸乙酯(7：3)为洗脱剂洗脱，分段收集，每份10ml，用硅胶薄层板跟踪检查(被洗脱的成分先后顺序为：大黄酚和大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素等)。合并大黄素部分，适当浓缩，放置析晶，过滤，即得纯品大黄素。5、 大黄素的鉴定在薄层板上用点滴反应检查大黄素对NaOH、MgAc2试液的反应测定大黄素的熔点。四、 操作要点1、 本实验多次使用乙醚，因此需注意安全防火，绝对禁止有明火的情况下使用乙醚。2、 采用梯度pH萃取法分离萃取各游离蔥醌成分时，操作不宜过分剧烈振摇，以免乳化，难以分层。3、 硅胶柱色谱整个操作过程硅胶柱表面应保持一定高度的洗脱剂，不使柱面溶液流干。4、 柱色谱洗脱时流速不应太快，以免柱交换来不及达到平衡，影响分离效果。5、 柱色谱时所用的仪器要干燥。五、 思考题1、 大黄中五种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？2、 梯度pH萃取法的原理是什么？适用于哪些中药化学成分的分离？3、 试分析薄层色谱图谱中各羟基蔥醌类成分的结构与Rf值的关系。

实验三槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定槐花米系豆科槐属植物sophorajaponicaL的花蕾，自古作为止血药。其中所含主要化学成分为芦丁，亦称芸香苷，药理实验证明芦丁具有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要用为防治高血压病的辅助治疗药物。此外，芦丁对于放射线伤害所引起的出血症亦有一定作用。芦丁广泛存在于植物界，已发现的含芦丁植物至少在70种以上，其中以槐花米和荞麦叶含量较高，可作为提取芦丁的原料。一、 实验目的和要求1、以芦丁为实例学习黄酮类化合物的提取分离方法2、掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的鉴定方法3、通过槲皮素的乙酰化反应，要求得到纯品槲皮素五乙酰化物4、掌握纸色谱和薄层色谱的方法及黄酮类化合物的色谱特点二、实验原理1、芦丁可溶于热水，难溶于冷水。其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱中易溶解，而在酸性条件下易析出沉淀。故可采用碱提酸沉法提取芦丁。2、利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖。通过纸色谱和薄层色谱及苷元的乙酰化衍生物进行鉴定和确认。三、实验方法1、芦丁的提取 于1000ml烧杯中加入500ml蒸馏水，煮沸2~3min后，称取40g槐花米（粗粉），投入沸水中，直火加热煮沸约5min，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH8〜9,加热微沸30min后，注意添加水，保持原体积并维持pH8~9，趁热过滤，滤渣再加入200ml水，加石灰乳调pH8~9，煮lOmin，趁热过滤，合并滤液，稍冷（60〜70°C）,用浓HCl调至4~5,放置后析出沉淀，抽滤，用水洗3〜4次，置空气自然干燥得淡黄色粗制芦丁。2、芦丁的精制将芦丁粗品置500ml烧杯中，加适量（约100ml）蒸馏水，再用石灰水调至pH8。加热煮沸数分钟，使充分溶解。趁热抽滤，滤液滴加3mol/LHCl调至pH7，放置18小时以上，即析出沉淀。减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2~3次。然后用少量乙醇洗1次。抽干，于70〜80°C干燥1小时，即得精制芦丁。称重，计算产率，测mp。3、芦丁的水解 取精制芦丁2g,研细，置于500ml圆底烧瓶中，加2%HS0溶液150ml，24于直火上加热微沸30min（要补充蒸发掉的水分），析出的黄色沉淀为槲皮素，趁热抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。沉淀经水洗后再用95%乙醇重结晶1次，得黄色针状结晶，于70~80C以下干燥，即得精制槲皮素。测mp。4、糖的纸色谱鉴定 取水解母液20ml，用Ba（OH）的细粉（约2.6g）中和至pH7，滤去2生成的BaSO沉淀（可用滑石粉助滤），滤液浓缩至约1ml，供纸色谱点样用。4样品：水解浓缩液色谱滤纸：新华一号滤纸对照品：葡萄糖、鼠李糖水溶液展开剂：正丁醇-乙酸-水（4：1：5上层）显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂喷后105C烘10min,显棕色和棕红色斑点。苯胺-邻苯二甲酸的配制：将1.66g苯二甲酸和0.93g的苯胺溶于100ml水饱和的正丁醇中。5、 芦丁、槲皮素的纸色谱和聚酰胺薄层鉴定样品：自制芦丁、槲皮素的乙醇溶液色谱滤纸：新华一号滤纸对照品：芦丁、槲皮素的乙醇溶液展开剂：（1）正丁醇-乙酸-水（4：1：5上层）（2）15%乙酸水溶液显色：（1）可见光下观察及紫外灯下观察（2） 经氨气薰后再观察（3） 喷三氯化铝试剂后再观察聚酰胺薄层的鉴定，用90%乙醇或乙醇-水（7：3）展开，在紫外灯下观察斑点颜色，或采用纸色谱的显色方法。6、槲皮素五乙酰化物的制备取槲皮素结晶200mg，置于圆底烧瓶中，加4ml无水吡啶溶解，再加5ml乙酸酐摇匀，接上空气冷凝管，水浴上加热回流30min，放冷。将反应液在搅拌下倾入100ml冰水中，一直搅拌至油滴消失，白色固体沉淀析出为止，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后用95%乙醇重结晶，得针状结晶，测其熔点（文献值为193〜195C）。四、操作要点1、 提取中加入硼砂，即能调节水溶液的pH,又有与芦丁分子中的邻二酚羟基结合，达到保护芦丁减少氧化的目的。但硼砂价格较贵，工业上用较大量的石灰加少量的硼砂，同样达到提高质量的要求。2、 搅拌下用石灰乳调节pH8~9，既可达到碱溶解芦丁的目的，又可除去槐花米中含有的大量果胶、粘液质、多糖等，使这些成分生成钙盐沉淀不致溶出。但pH不可过高，否则钙离子能与芦丁形成螯合物析出而降低收率。3、 用浓盐酸酸化调pH4~5，pH不宜过低，以免芦丁形成钅羊盐，重新溶解，降低收率。4、 槲皮素五乙酰化衍生物制备中，所有仪器均要干燥。五、思考题1、 提取芦丁工艺中影响产量与质量的因素是什么？为什么要加硼砂水沸溶液？2、 使用去离子水或蒸馏水的目的？为什么？3、 芦丁水解不完全时将产生什么结果？4、 黄酮类化合物有哪些提取方法？芦丁的提取还可以用什么方法？5、 芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开，将出现什么结果？为什么？6、 芦丁和槲皮素聚酰胺薄层将出现什么结果？为什么？7、 槲皮素乙酰化衍生物的制备应注意什么？如何证明芦丁分子中只含有葡萄糖和鼠李糖？如何证明苷元、葡萄糖、鼠李糖的连接位置？实验四薯蓣皂苷元的提取、分离和鉴定我国薯蓣皂苷元资源极为丰富，薯蓣略的八十多种植物中大多含有薯蓣皂苷，其中可用于生产薯蓣皂苷元的植物原料有穿山龙，盾叶薯蓣，山萆解等，用其根茎提取薯蓣皂苷元。薯蓣皂苷属于甾体皂苷，经水解后可以得到属于甾体结构的薯蓣皂苷元，是合成甾体激素的重要原料。一、实验目的和要求1、 掌握苷类的酸催化水解方法2、 掌握甾体皂苷元的提取方法3、 掌握甾体皂元的检识方法4、掌握索氏提取器的应用二、已知主要成分的理化性质穿山龙根中含有多种甾体皂苷，其中薯蓣皂苷含量最高。这些皂苷水解后大多能生成薯蓣皂苷元。1、薯蓣皂苷无定形粉末或针状结晶，mp288°C,[a]D-95°。可溶于乙醇、甲醇、醋酸、难溶于乙醚等弱极性有机溶剂，不溶于水。2、 薯蓣皂苷元白色针状结晶（乙醇），mp204~207C（丙酮）或202〜204,[a]D2-129.3°（氯仿）。可溶于一般有机溶剂及醋酸中，不溶于水。三、实验原理薯蓣皂苷元在植物体内与葡萄糖、鼠李糖结合成薯蓣皂苷，经酸水解生成薯蓣皂苷元和单糖。由于薯蓣皂苷元不溶于水，留存于植物残渣中，所以可用有机溶剂直接从植物原料残渣中连续回流将其提取出来。四、实验方法（一）薯蓣皂苷元的提取分离方法1、苷的酸水解取穿山龙25g，切成碎片，置500ml圆底烧瓶中，加8%酸水（水-浓硫酸230：20V/V）,然后直火加热（石棉网上），回流6小时（开始用小火，以防泡沫冲出）。倒去酸水，加入常水洗涤两次，然后将药渣倒在乳钵内，加固体碳酸钠粉研磨，调pH至中性，常水洗，过滤（用尼龙布），滤渣研碎，低温干燥（不超过80C），得干燥药渣。2、 薯蓣皂苷元的提取将上述干燥药渣装入滤纸筒置索氏提取器内，用石油醚（沸程60〜90C）300ml，在水浴上连续回流提取4~6小时，提取液常压回收石油醚至约10〜15ml,迅速用吸管转入小锥形瓶中，冷却，析出结晶，抽滤，固体用少量新鲜石油醚洗涤两次，抽干，即得薯蓣皂苷元粗品。干燥，称重，计算得率。3、 精制将上述粗品用20〜30ml95%乙醇加热溶解（色深时可加1〜2%的活性炭脱色），趁热抽滤，滤液放置，析出结晶。滤集结晶，干燥，即得薯蓣皂苷元精品。称重，计算得率，测定熔点mp204〜207°C。（二）薯蓣中皂苷与皂苷元的鉴定1、皂苷的鉴别（1）泡沫试验取穿山龙的水浸出液2ml,置小试管中，用力振摇lmin,如产生多量泡沫，放置lOmin,泡沫没有显著消失，即表明含有皂苷。另取试管二支，各加入穿山龙热水浸出液lml，一管内加入2mlO.lmol/L氢氧化钠溶液，另一管加入2mlO.lmol/L盐酸溶液，将两管塞紧用水振摇lmin，观察两管出现泡沫的情况。如两管的泡沫高度相近，表明为三萜皂苷，如含碱液管比含酸管的泡沫高过数倍，表明有甾体皂苷。（2）溶血试验2、皂苷元的显色反应（1）硫酸-醋酐试剂薯蓣皂苷元结晶少许，置白磁板上，加硫酸-醋酐试剂2〜3滴，观察颜色由红〜