碱提取-酶解法提取砂黄海中的粘多糖

碱提取-酶解法提取砂黄海中的粘多糖

氨基酸又名氨基酸多样性，也被称为氨基葡萄糖。它起着防洪、肿瘤、抗凝剂、降血率、抗辐射和身体免疫功能等多种作用。现在它已被广泛使用到医药、护理等行业。20世纪80年代，中国开始研究动物来源的氨基酸粘多糖，主要集中在海洋上可食用动物，而其他动物的研究很少。砂海星属棘皮动物门(Echinodermata)海星纲(Asteroidea),在山东沿海特别是胶东半岛有大量分布,资源丰富,其酸性粘多糖的研究未见报道.本研究就砂海星的酸性粘多糖进行了初步分离纯化及性质鉴定,以期为砂海星的开发利用提供参考依据.1材料和方法1.1样品采集和粉碎实验用材料砂海星(LuidiaquinariavonMartens)于2006年4-5月采集自山东烟台牟平区附近海域潮下带,标本存放于烟台大学海洋生物学实验室.样品新鲜时用水冲洗净泥沙,自然风干,用粉碎机粉碎(约40目左右),置阴凉通风处备用.1.2纯或生化试剂的筛选20PR-520型冰冻离心机,SP-2000UV型紫外可见分光光度计,TH-500梯度混合器,HD-3紫外检测仪,BSZ-100自动部分收集器,LM-17型记录仪,DHL-A电脑恒流泵等.枯草杆菌中性蛋白酶,蒽酮,葡萄糖,DEAE-52,考马斯亮蓝G250,葡聚糖(Sephadex)G-50、G-100,蓝色葡聚糖,对氨基苯磺酸,DextranT-10,DextranT-40,DextranT-70,异戊醇等.以上试剂均为分析纯或生化试剂.1.3中性蛋白酶的制备称取500g样品,加入2000mL0.1mol/LNaOH与0.1mol/L的硼氢化钠溶液,60℃搅拌过夜.冷却后用三氯乙酸调pH至4.00,5000r/min离心15min;取上清液,将pH调至7.00,加入5g枯草杆菌中性蛋白酶,50℃搅拌过夜,5000r/min离心15min;取上清液,加入5%的双氧水脱色,加入量约为样品液体积的1/8,55℃保温至溶液变为浅黄色,将脱色后的溶液浓缩至合适体积,按1∶4加入95%的乙醇,5000r/min,30min,取沉淀溶于适量蒸馏水中,水浴60℃,使其充分溶解.将pH调至7.0,加入3g枯草杆菌中性蛋白酶,50℃搅拌过夜,酶解完毕后,三氯乙酸调pH至4.00,8000r/min离心20min,取上清液加入乙醇使乙醇体积分数为42%,8000r/min离心20min;取沉淀用乙醇和丙酮洗涤,摊于平皿上,50℃真空干燥,得到精制砂海星粘多糖I,上清中再次加入乙醇,使乙醇体积分数为80%,操作同上,得到精制砂海星粘多糖II.1.4蛋白质含量和总糖含量的测定用蒽酮比色法测定总糖含量,用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量,均参照文献的方法进行.蒽酮比色法测定总糖含量时,用葡聚糖作标准曲线.1.5硫酸基的鉴定和颜色反应分别参照文献及的方法进行.1.6样品的制备DEAE-52纤维素柱(2.6cm×25cm),梯度洗脱:用0-1mol/L氯化钠溶液(以10mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液配制),以30mL/h的速度洗脱,检测器波长调至220nm处跟踪记录,上样样品为精制砂海星粘多糖II;将峰值管中样品收集备用.1.7水体积测定葡聚糖SephadexG-50的预处理及装柱:将其先用水煮沸约4h,待其冷却至室温,抽气,装柱(1.6cm×50cm),柱床上方盖一大小合适的滤纸片,以30mL/h的流速平衡过夜.内外水体积测定:用1mg/mL的蓝色葡聚糖与0.1mg/mL对氨基苯磺酸溶液上样,以30mL/h的速度洗脱,在波长为254nm时跟踪记录.上样及洗脱:以10mL/h的速度上样,待样品完全进入柱床后加盖3cm缓冲液,用15mL/h的速度洗脱,检测器波长调至220nm处跟踪记录.1.8多酚氧化酶的测定参照文献的方法进行.2结果与讨论2.1砂海砂糖组的表观特性从砂海星提取的酸性粘多糖为乳白色无定形粉末,H2O2脱色和真空干燥能有效改善砂海星多糖的色泽.2.2糖及蛋白质含量测定实验总糖和蛋白质含量测定的结果见表1、2.样品测定均设2个重复.酸性粘多糖提取要解决的主要难题为:在多糖不被显著降解的情况下除去结合蛋白.此过程中,不仅要破坏多糖聚集体间的次级键,更主要的是要破坏糖链与蛋白质间的糖肽键,从而释放出多糖.本实验采用碱提法和酶解法相结合以及二次酶解,可以提取到纯度较高的酸性粘多糖,二次酶解后精制酸性粘多糖中的总糖含量分别为71.6%和80.4%,蛋白质含量分别为1.52%和1.38%(一次酶解后,粘多糖的蛋白质平均含量约为10%),二次酶解可显著减少粘多糖中的蛋白质含量.每次进行的糖及蛋白质含量测定实验,均平行做了3个样品,重复性好,数据均为平均值.2.3莫氏试剂中沉淀的检测硫酸基的鉴定表明样品液中含有硫酸根:在糖的盐酸裂解液中加入BaCl2溶液,则变混浊,静置片刻,有白色沉淀出现.将沉淀取出加入到稀硝酸中,沉淀不溶解,证明沉淀为硫酸钡而不是碳酸钡,由此可知样品液中含有硫酸根.将莫氏试剂与样品裂解液混合后,在硫酸和水的液面交界处有红褐色环带出现,试管中液体呈现浅绿色;将塞氏试剂与样品裂解液混合并置于沸水浴中,样品液为浅黄色.结果表明样品含醛糖,不含酮糖.2.4考察配方的作用如图1所示,DEAE-52纤维素柱纯化洗脱曲线只有一个明显的峰,说明样品中组分在该条件下大多数分子所带电荷数量较为均一(但不能确定是否为同一种物质,有待于进一步研究).2.5柱洗脱体积和峰洗脱体积分子筛SephadexG-50柱的内水体积为31.2mL,柱外水体积为70.8mL,柱总体积102mL.样品峰洗脱体积为91.0mL.将经离子交换得到的样品用SephadexG-50进行分离,得到一个较为明显的峰,且洗脱体积在内水体积(图2).说明样品中含有一种较为均一的主要组分.2.6分子筛表面活性剂的检测法结果见表2.用3种分子量的标准糖混合液(DextrinT-10;DextrinT-40;DextrinT-70,每种标准糖约70mg)上SephadexG-100柱,得到3个比较明显的峰.同样条件下,用经离子交换得到的酸性粘多糖样品0.15g上柱,结果见图3.分子筛SephadexG-100柱的内水体积为28.0mL,外水体积为64.7mL.由图3可以得出,待测样品峰洗脱体积为83.3mL.由图4得分子量标准曲线为:y=-1.0881x+5.0188,经计算知样品平均分子量约为12200.3砂海运粘多糖的理化性质用碱提法结合酶解法能有效地从砂海星中提取酸性粘多糖,样品粉末可溶性良好.双氧水可有效将其脱色;二次酶解可有效去除结合蛋白,乙醇分级沉淀后可得到砂海星酸性粘多糖Ⅰ、Ⅱ,总糖含量可达到71.6%和80.4%,蛋白质含量则降低为1.52%和1.38%.并对粘多糖Ⅱ进行进一步研究后,发现其为酸性粘多糖,含有硫酸根,