红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展

红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展

到目前为止，紫金醇及其相似植物只有福建省的红杉和红杉科，但分布分散，生长缓慢。澳大利亚红杉只有少数种类，数量非常少。红杉和红杉的含量普遍很低。目前，公认的最小红杉树皮只有0.069%。然而，世界对其的需求非常高。为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾,多年来,科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了大量工作.紫杉醇的全合成已取得成功,但皆因路线长,收率低等原因目前无法实现工业化.化学半合成是一条扩大紫杉醇来源的较好途径,国外已用半合成法生产紫杉醇.但化学半合成所用前体巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭III等仍要依赖于从红豆杉属植物中提取,限制了它的应用.利用生物技术生产紫杉醇是一种大有前途的途径.本文就红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展进行了综述.1紫杉醇是在蘑菇细胞中培育和生产的1.1代谢调整1.1.1苯丙氨酸和乙酸钠对紫杉醇合成的影响前体饲喂细胞一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率,另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行,有效提高紫杉醇产量.文献报道在东北红豆杉(Taxuscuspidata)的培养中选用了多种前体:苯丙氨酸、苯甲酸、苯甲酰甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸,结果表明它们不论在愈伤培养还是悬浮培养中均能显著促进紫杉醇合成.Fetto-Neto认为苯甲酸可能结合到紫杉醇的侧链上,亦或提供苯甲酰基团,促使C-13侧链上的苯基异丝氨酸发生酰化反应;甘氨酸、丝氨酸能够进入莽草酸途径,从而促进苯丙氨酸和(或)苯甲酸的合成;苯甲酰甘氨酸也可水解为苯甲酰和甘氨酸2部分,从而间接促进紫杉醇的合成.在云南红豆杉(Taxusyunnanensis)的悬浮培养中添加苯丙氨酸、乙酸钠、丙酮酸钠和香叶醇,发现苯丙氨酸可显著促进云南红豆杉细胞的生长和紫杉醇的合成,而乙酸钠对细胞的生长及紫杉醇的含量和产量均影响不大.在培养第12天向培养基中补加5mmol/L的丙酮酸钠对细胞的促进作用较小,但可显著提高紫杉醇的含量和产量,其含量和产量分别比对照组增加74.5%和95.7%.20mmol/L的丙酮酸钠对细胞有毒害作用.香叶醇对细胞的生长影响不大,但使紫杉醇的含量和产量分别提高了115.5%和121.3%.以中国红豆杉(Taxuschinensis)S11细胞系作实验材料,向愈伤组织中添加苯甲酸、乙酸、苯丙氨酸和β-苯丙氨酸的结果表明,只有添加β-苯丙氨酸有利于愈伤组织的生长,但是其促进效果并不显著.苯甲酸、乙酸、苯丙氨酸均抑制愈伤组织增殖,尤其是苯甲酸的抑制作用最强.文献也发现低浓度的苯丙氨酸使细胞生物量和脱氢酶活力略有提高,苯甲酸钠对细胞生长有一定的抑制作用,但在较低浓度下对细胞生长影响不大.从紫杉醇的合成来看,只有添加β-苯丙氨酸的紫杉醇含量有所提高,加入苯甲酸、乙酸、苯丙氨酸反而使紫杉醇的含量降低.用TaxuscuspidataB6细胞系和TaxuscuspidataB10细胞系进行了添加苯丙氨酸的实验,但结果均未显示出紫杉醇含量的提高.从紫杉烷类化合物的含量来看,添加苯甲酸、乙酸、显著促进了10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ和浆果赤霉素Ⅲ的合成,而添加苯丙氨酸和β-苯丙氨酸对紫杉烷类化合物的含量没有明显影响.据此得出结论:C-13位侧链前体的量不是影响紫杉醇合成的限制性因素,或者说至少在他们的细胞系中不是.采用正交实验证实苯丙氨酸与乙酸铵的协同作用比单独使用效果好,二者的最适浓度分别为10mg/L和5mg/L.乙酸铵能够进入甲羟戊酸途径并参与紫杉醇母核基团的形成,苯丙氨酸是侧链合成的前体,因此它们具有较好的协同效应.蒎烯是多萜合成的前体,又是部分单萜旁路抑制剂,导致物流流向二萜途径,从而促进紫杉醇的合成.1.1.2紫杉醇和紫杉烷类化合物单产物的合成在中国红豆杉(Taxuschinensis)悬浮培养细胞添加单萜合成抑制剂,α-蒎烯,松油醇,樟脑.除松油醇外,α-蒎烯、樟脑、α-蒎烯+松油醇以及α-蒎烯+松油醇+樟脑对红豆杉细胞生长有较大影响,但对紫杉醇的生物合成都有促进作用.三者同时添加将全面阻止能量和物流过多流向单萜3个旁路途径,使更多的能量和物流集中到由单萜合成二萜的途径中来,从而提高了紫杉醇的产量.选择Taxuschinensis的S11细胞系作实验材料考察了赤霉素(GA3)和矮壮素(CCC)对紫杉醇和紫杉烷类化合物的影响.赤霉素是辅助生长素促进细胞分裂的植物激素,添加1mg/L赤霉素可以提高干物质含量,随着赤霉素的浓度提高其增长率有所下降.其结果说明高于1mg/L以后赤霉素并不能促进细胞增值.添加赤霉素的拮抗物质矮壮素在低浓度对于细胞的增殖没有显著的抑制作用,但是随着矮壮素的浓度提高,无论是愈伤组织的干重还是其增长率均呈下降趋势,这表明矮壮素确实具有抑制细胞生长的作用.在培养基中加入2mg/L赤霉素或1mg/L矮壮素后紫杉醇的含量得到显著提高,并分别提高到对照组的174.3%和133.5%.从总体来看,添加赤霉素或矮壮素没有促进紫杉烷类化合物总量的增加,其不同浓度处理也未表现出紫杉醇或紫杉烷类化合物的含量有规律性变化,这可能与植物生长调节物质的性质有关,只有在某个浓度范围内才有明显的促进作用,低于或高于此浓度时其效果截然不同.1.1.3茉酸甲酯的诱导作用紫杉醇是二萜类化合物,与植物防卫系统对抗昆虫和病源菌侵袭产生植保素的合成路径有部分重叠,诱导子能够通过刺激植物防卫系统而促进紫杉醇的代谢,形成更有利的产物分布,同时诱导产物分泌入培养基.茉莉酸甲酯(methyljasmonate)作为细胞信号转导系统中的一种重要物质,广泛参与了植物防御信号的转导与放大过程.在不同培养时间加入不同浓度的茉莉酸甲酯,发现均能促进紫杉醇合成,只是增加量略有不同.其中,以继代培养7d后加入100μmol/L作用效果最为明显,产量可达14.4mg/L.茉莉酸甲酯对紫杉醇有很强的增产作用,而对巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)和三尖杉宁碱(cepholamanine)作用不显著.另外将茉莉酮酸(jasmonateacid)、南瓜酸甲酯(methylcucurbate)、同型茉莉酮(cisjasmonate)与之比较使用,发现只有茉莉酮酸有一定作用.文献研究了茉莉酸甲酯对红豆杉胚性细胞生物合成紫杉醇的影响.茉莉酸甲酯的加入时间和浓度与紫杉醇产量有明显相关性,茉莉酸甲酯在对数生长期初期至稳定期之前加入且浓度为100μmol/L时,诱导作用显著.文献研究了茉莉酸甲酯构型对紫杉醇和baccatinⅢ生产的影响.发现(3R,7S)和(3R,7R)-构型的茉莉酸甲酯对细胞生长表现出很强的抑制作用,而(3S,7R)和(3S,7S)-构型的茉莉酸甲酯对细胞生长表现出较小的抑制作用.表明3R-构型与其抑制作用有较大相关性.对促进紫杉醇和baccatinⅢ含量而言,(3R,7R)和(3S,7R)-构型的茉莉酸甲酯表现出较强的活性.另外2种构型则表现出相反的活性.这表明7R-构型的茉莉酸甲酯有利于紫杉醇和baccatinⅢ在细胞内的积累.通过茉莉酸甲酯的短期诱导实验和拟稳态转移模型分析,确定其作用位点在baccatinⅢ与紫杉醇之间,即通过提高baccatinⅢ合成紫杉醇的酶活力来提高紫杉醇的产量.以5mg/L茉莉酮酸诱导红豆杉愈伤组织,紫杉醇含量为134.3μg/gDCW,是对照组的9.7倍.结果表明紫杉醇确是一种植物防卫素,可以被诱导子所诱导.花生四烯酸的诱导效果也较好,浓度为5μg/g时即可将紫杉醇含量提高9.3倍,而baccatinⅢ量不增加.茉莉酸甲酯与花生四烯酸的配伍实验中最高的紫杉醇产量达到82.1mg/L,比2个诱导子单独作用时的产量之和还高出54%,表现出明显的诱导协同作用.水杨酸作为一种重要的细胞信使与植物抗毒素,可以诱导呼吸方式从细胞色素呼吸途径到交替呼吸途径的转变,为植物病理反应提供物质、能量以及信号传导的基础.在水杨酸的短期诱导实验中通过紫杉醇合成代谢途径的动力学分析,初步推断其作用部位在10-deacetylbaccatinⅢ之前.在配伍实验中,硝酸银和水杨酸配伍有明显的协同作用,其紫杉醇含量比2个诱导子单独作用时的最高含量之和还高出50%;而花生四烯酸和水杨酸的配伍紫杉醇含量仅比花生四烯酸单独诱导时略高,远小于2个诱导子单独作用时紫杉醇最高含量之和.文献发现油菜素内酯对紫杉醇的合成也具有诱导作用.添加17ng/L的油菜素内酯可使紫杉醇的含量提高100%.利用重金属盐作为促进细胞合成与释放紫杉醇的诱导子已有较多工作发表.文献研究了镧、铈对东北红豆杉悬浮细胞生长及紫杉醇合成与释放的影响.发现镧、铈能不同程度地提高细胞中紫杉醇的合成与释放,其中以正二价的铈离子效果最显著.平稳期加入稀土有利于生物量的积累,但对每升发酵液中紫杉醇总量而言,对数期加入稀土化合物效果更好.实验结果表明在指数生长期末红豆杉培养细胞对Cu2+诱导处理具有最强的反应能力.培养基中添加浓度在0.5～100μmol/L之间的CuCl2,均能诱导紫杉醇的合成.然而,文献的结果却完全相反,添加0.06mg/L(0.94μmol/L)和0.12mg/L(1.88μmol/L)的Cu2+抑制了紫杉醇的合成,文献的结果表明,在Taxusbaccata的悬浮培养物中添加0.05mmol/L的VSO4可使紫杉醇和baccatinⅢ的产量分别提高到对照组的250%和360%.硫酸钒酰的加入可以显著促进细胞中紫杉醇的形成.其中以10mg/L处理效果最好,细胞的紫杉醇含量和产量分别比对照组增加了1倍.真菌诱导物对红豆杉细胞的生长有强烈的抑制作用,真菌诱导物大都可以不同程度地提高紫杉醇的含量,其中F3的效果最好,细胞中紫杉醇的含量达到干重的0.07%.在悬浮培养的南方红豆杉细胞体系中,细胞进入指数生长期末期时加入真菌诱导子,次生代谢产物中紫杉烷类的生物合成均得到了加强,其中紫杉醇的含量得到大幅度提高,达到对照组的5倍左右.在真菌诱导子诱导与水杨酸联合作用下提高紫杉醇的产量可能与水杨酸减轻真菌诱导子所引起的膜脂过氧化程度有关.1.2b培养基中各养分含量对细胞生长和代谢的影响通过对氮、磷等无机盐在红豆杉细胞悬浮培养中的吸收状况、无机盐对细胞产量及紫杉醇产量的影响的研究表明,培养液中的磷酸盐在培养初期(0～6d)迅速、大量地被吸收;中期(18d)时几乎降到0;但到培养后期则又可检测出磷酸盐的存在,说明此时细胞中的磷酸盐向外渗透到了培养液中.与此相反,硝酸盐的吸收率则较缓慢,尤其在培养的中期.向云南红豆杉细胞悬浮培养液中加入不同浓度(0～0.8g/L)的硝酸铵对细胞的生长无明显影响,但紫杉醇的产量则随硝酸铵加入量的增加而逐渐减少,说明过高浓度的氮对紫杉醇的生产有一定抑制作用.在B5培养基原有氮源的基础上,增加了不同浓度的硝酸铵.结果表明,增加的氮源对细胞生长和紫杉醇含量在所用的各种浓度下均未起很大作用.据此认为基本培养基中的无机盐成分足以满足红豆杉悬浮细胞的生长和代谢的需要,一般无须再额外添加无机盐.在南方红豆杉细胞悬浮培养过程中,B5培养基中的各元素基本满足细胞生长需要,培养中后期氮源和磷源仍能满足细胞生长代谢的需要.1.3紫杉醇的合成在培养液中添加不同种类和浓度的生长激素对悬浮细胞的生长和紫杉醇的产量都有一定的影响.文献研究了NAA和BA的配比对愈伤组织生长及生产紫杉醇的影响.表明随着BA浓度的增加,愈伤组织的生物量呈现下降趋势,相比之下,NAA对愈伤组织的影响较小.对紫杉醇合成而言,除NAA和BA的质量浓度比为1∶1的结果除外,紫杉醇的合成随着BA浓度的升高而增加.综合考虑紫杉醇的总产量,NAA和BA的浓度各为1mg/L的配比为最佳激素比例.在云南红豆杉细胞的悬浮培养中发现,低浓度的2,4-D(0.5～1.0mg/L)比较适合于紫杉醇的合成,而较高浓度的2,4-D(1.0～2.5mg/L)则比较适合于细胞的生长.综合2方面的因素,较佳的2,4-D浓度为1.05mg/L.使用IAA比2,4-D更能有效地提高紫杉醇的产量,而使用NAA时紫杉醇的产量变化与使用2,4-D的结果相差不大.这表明,当细胞分裂素与生长素联合使用于细胞悬浮培养时则具有更好刺激生长的效果.对紫杉醇生产而言,IAA与BA结合使用是最好的组合,紫杉醇的产量可达14.78±0.86mg/L.此外,2,4-D或IBA与BA的组合也能有效地提高紫杉醇产量.为了达到高产量紫杉醇的目的,适当地调整生长素与分裂素的比例至关重要.适度的2,4-D和KT比例可以改善细胞生长状态和提高紫杉醇产量.1.4糖源与紫杉醇配比对紫杉醇合成的影响很多实验已证明高浓度的蔗糖能提高培养细胞中次生产物的含量,其原因之一是提高了培养基的渗透压因而刺激次生产物的形成.在细胞悬浮培养生产紫杉醇的研究中,有的学者专门对糖分的作用进行了分析.在蔗糖浓度为20～30g/L时,培养细胞的生长较好,低于此浓度范围,生物量急剧下降.但紫杉醇的含量只有在较高浓度的蔗糖(40g/L)情况下才达到最高点.认为果糖对促进细胞生长的效果最好,但以单一的果糖为碳源时,细胞在继代若干次后将会出现死亡.半乳糖可以促进细胞产量的增长,山梨醇和甘露醇虽然不能促进细胞生长,但可以刺激紫杉醇的合成,各种糖分的最适宜浓度为6%,果糖是获得紫杉醇高产的最佳碳源.在中国红豆杉的两相培养中于第20天添加30g/L的蔗糖,使紫杉醇的合成期由通常的27d延长至37d,从而使紫杉醇的产量达到36.0±3.5mg/L,比对照提高了3倍.在南方红豆杉细胞双液相培养中发现,添加麦芽糖、蔗糖配比作为生产培养基的混合糖源可明显提高紫杉醇的产量.用高浓度糖构成的渗透胁迫可显著促进杂种红豆杉中紫杉醇的合成.向培养基中添加6g/L的果糖,可以使紫杉醇含量增加63.89%.1.5超声处理对紫杉醇产量的影响气体组合也会较大地影响紫杉醇的含量.根据紫杉醇的产量,最为有效的气体混合组成是10%(体积分数)氧气,0.5%(体积分数)二氧化碳和5×10-6乙烯.在这种条件下,21d紫杉醇的含量达到6.5mg/L.研究认为,此可能与气体比率影响了细胞对营养成分的吸收有关.超声对红豆杉细胞中紫杉醇的积累与释放都有影响.超声处理的悬浮细胞,在超声处理后3d,就已达到胞外紫杉醇1mg/L的水平,其峰值出现在超声处理后21d,达到6.7mg/L,比对照组提高了近6倍.超声处理后,胞内紫杉醇含量与对照组相比,无明显变化.总的紫杉醇产量在超声处理后比对照组提高了47%.但