蛋白质组学研究方法的研究进展

蛋白质组学研究方法的研究进展

随着生命现象的研究，从获得遗传信息到研究基因功能的转变，新学科的蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。1噬菌体展示技术大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd和M13,它们只感染含F因子的大肠杆菌。1985年,美国Missouri大学Smith博士等人将RI核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被EcoRⅠ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phagedisplaytechniques,PDT)的诞生。噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott等人利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方式。由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸,所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依赖的氨基酸残基,从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别,酶与底物的结合等等,突破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致性。到现在已相继成功构建了f1、M13、T4等噬菌体表达载体,为蛋白质组学的发展提供了有利的工具。Jespers等利用噬菌体展示技术,通过热变性发展了一种选择抗凝集蛋白的方法,这一方法的建立对于抗凝集蛋白的选择、鉴定;防止或促进蛋白的凝集反应以及诊断由凝集蛋白引起的疾病等方面都意义重大。2酵母双杂交活性体的构建酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作用的标准方法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角色。Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的详细了解。GAL4包括两个可以独立的结构域:N末端的DNA结合域(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和C末端的转录激活域(Transcriptionactivatingdomain,DNA-AD)。DNA-BD可以与DNA分子的上游激活序列结合,DNA-AD则可以激活下游基因的转录,只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。双杂交技术正是利用了GAL4的这一特点,将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA-BD和DNA-AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。酵母双杂交系统简单快速,最常用于鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白,同时也是发现新的蛋白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究手段。TRPC通道是一组Ca2+流量调节通道蛋白,研究证明磷脂酶Cγ1(phospholipaseCγ1,PLC-γ1)结合并控制该通道,对降低Ca2+流量是必要的,但一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。Rossum等人应用Y2H系统,构建了pGBKT7-BD-TRPC3和pGADT7-AD-PLC-γ1两个载体,共同转化到酵母当中,以Lacz为报告基因,发现PLC-γ1只特异的与TRPC3相结合。实验人员又构建了载有不同氨基酸长度TRPC3与PLC-γ1的双杂交系统,发现TRPC3与PLC-γ1的相互作用只依赖于TRPC3中对应的PH相似结构域中40~46个氨基酸,从而建立了一个广泛的信号转导模型。3tap数据库的纯化近年来质谱技术发展迅速,其功能强大且灵敏度高,常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基,但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合体,成为质谱在这方面应用的一个限速步骤。1999年Rigaut等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法——串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP),兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签,该标签由IgG结合结构域(ProtA)及一个钙调蛋白结合多肽(CBP)组成,结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因,温和裂解细胞,获取细胞抽提物,将抽提物加入IgG亲和柱,TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。利用串联亲和纯化技术,通过对洗脱后的复合体作质谱分析或电镜观察,可以快速的发现细胞中新的蛋白质复合体或鉴定出复合体中的新组分。Dziembowski等人应用TAP技术,纯化分析了酿酒酵母(Saccharomycescerevisie)前体mRNA拼接酶复合体-U2微小核糖核蛋白颗粒(smallnuclearribonucleoproteinparticle,snRNP)关联拼接因子SF3a和SF3b。在对SF3b的纯化中分离出了一个新的重要的蛋白亚基Ysf3p。按照先前的观点,认为在酵母SF3b中存在一个Snu17p亚基,是人类SF3b因子中p14亚基的直系同源物,在此次试验中却发现Snu17p不属于酵母SF3b因子,而是属于本实验中新发现的另一个拼接酶复合体RFS的一个组分。4荧光共振能量转移理论采用标签法检测和分离蛋白的方法虽然有效但也存在缺点,比如说分离蛋白标签可以改变蛋白的溶解性并且不能在活体细胞中进行等。荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是近年来迅速发展的一种新技术,其最大的特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究,已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。一对合适的荧光物质构成一个能量供受体对时,能量在它们之间可以发生转移,1948年Förster提出的这一荧光共振能量转移理论奠定了FRET技术的理论基础。1992年,Prasher等首次从维多利亚水母中分离并克隆了一种荧光物质——绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)。随后,Heim等通过点突变等方式,得到了多种荧光光谱不同的荧光蛋白,如蓝色荧光蛋白(bluefluorescenceprotein,BFP),黄色荧光蛋白(yellowfluorescenceprotein,YFP)和蓝绿色荧光蛋白(cyanfluorescenceprotein,CFP)等,提供了大量的能量供受体,为FRET技术提供了现实基础。目前FRET技术中常用的荧光蛋白对是YFP和CFP,当与荧光基团融合的被研究蛋白发相互作用时,荧光基团在空间上靠近,发生能量转移,通过检测供受体分子发射程度比率的变化就可得知蛋白质结合程度的强弱。目前,FRET技术已在检测酶活性变化、膜蛋白的研究、信号转导、细胞周期调控等研究中发挥了重要作用。例如在细胞凋亡相关蛋白的研究中,天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡的执行期发挥关键的作用。Reiko等利用FRET技术研究了Caspase8与其底物Bid蛋白质间的相互作用,将Bid蛋白两端分别与CFP和YEP融合,精心设计使其在没有被酶裂解前刚好可以发生共振能量转移,当Bid蛋白被裂解后,能量转移效应自然消失,从而很好的检测了Caspase8酶的活性。5金属膜内表面电子共振spra的发展表面等离子共振是数理科学与生物学相互渗透、结合而产生的一种全新的研究生物大分子之间相互作用的方法,近几年在生物技术领域得到了广泛的应用。表面等离子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)是一种物理光学现象,当一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属膜上发生全反射时,若入射光的波向量与金属膜内表面电子的振荡频率相一致,光线即被耦合入金属膜引发电子共振,即表面等离子共振。由于共振的产生,导致反射光的强度在某一特定的角度大大减弱,反射光消失的角度称为共振角(SPRangle),共振角随金属表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又与金属表面结合物的分子质量成正比。由此,在20世纪90年代发展了应用SPR原理检测生物传感芯片(biosensorchip)上的配位体与分析物作用的一种新技术——表面等离子共振。在该技术中,待测生物分子被固化在生物传感芯片上,使另一种被测分子的溶液流过表面,如二者发生相互作用,就会引起芯片表面折射率的变化,从而导致共振角的改变,通过检测该共振角的变化,就可实时监测分子间的相互作用。1992年,Fagerstam等首次将此技术用于生物特异相互作用分析(biospecificinteractionanalysis,BIA)之后,由于该技术快速、安全、无需标记以及高灵敏度等特点,已被广泛用于分析生物分子如蛋白质间、蛋白质与核酸、核酸之间的相互作用,涉及免疫识别、信号传导、药物筛选和蛋白质构象变化等多个研究领域。6国内蛋白质研究的发展方向机体细胞内蛋白质之间相互交叉作用形成网络,构成各项生理活动的基础。因此了