琼脂糖凝胶电泳

本文格式为Word版，下载可任意编辑——琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳

1.原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛〞和“电泳〞的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分开不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辩能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辩率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备简单，分开范围广。普通琼脂糖凝胶分开DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分开高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，一致数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2操作流程

准备清白的配胶板和电泳槽

琼脂糖凝胶电泳：水平电泳

注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。(1)电泳方法

1

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；假使需要分辩率高的电泳，特别是只有几个bp的区别应选中择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不适合的巨大DNA链应当使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。(2)凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度寻常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，防备操作和使用质量好的琼脂糖是解决方法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辩，造成条带缺失现象。(3)缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液屡屡使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学试验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学试验中常用的TAE和TBE缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。(4)电压和温度

电泳时电压不应当超过20V/cm，电泳温度应当低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应当低于15℃。注意假使电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

(5)DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。(6)DNA的上样

2

正确的DNA上样量是条带明了的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。(7)Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应选中择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较确凿。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。假使选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

(8)凝胶的染色和观测

试验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作便利，但是稳定性差，具有毒性。注意观测凝胶时应根据染料不同使用适合的光源和激发波长，假使激发波长不对，条带则不易观测，出现条带模糊的现象。3回收编辑

(1)DNA片段的胶回收方法

电泳洗脱法

低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)胶回收本卷须知

a.将电泳槽用ddH2O反复清洗清白，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液；

3

b.根据点样量制备适合厚度的琼脂糖凝胶板；c.切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；

d.要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；e.熔胶要完全。

loadingbuffer

loadingbuffer的中文名字叫上样缓冲液，6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫兰色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致一致；后面的兰色条带是二甲苯青，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相像。而对于PAGE胶他们的迁移速率也分别不同。1.主要用途

loadingbuffer的功能主要有两个：

第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯青FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；

其次，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。

另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，由于没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。2.制备方法

loadingbuffer一般配置：(1)6×Loadingbuffer:30mMEDTA36%(v/v)Glycerol

0.05%(w/v)XyleneCyanolFF0.05%(w/v)BromophenolBlue主要用于DNA电泳

4

(2)10×Loadingbuffer:30mMEDTA50%(v/v)Glycerol

0.25%(w/v)XyleneCyanolFF0.25%(w/v)BromophenolBlue主要用于RNA电泳

注：（1）10×loadingbuffer中仅有色素溴酚蓝（BromophenolBlue)一种染料（浓度0.05%）；

（2）6×loadingbuffer中含色素溴酚蓝（BromophenolBlue)、二甲苯青蓝FF（XyleneCyanolFF)两种染料（浓度都是0.05%）

在琼脂糖凝胶（0.5%~1.4%）中溴酚蓝（BromophenolBlue）约与300bp的双链线状DNA的迁移速度一致，二甲苯腈蓝FF则与4kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。

6×loadingbuffer是用来上样的；10×loadingbuffer是stopbuffer，是中止酶促反应的，假使一定要用10×loadingbuffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10×loadingbuffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，假使电泳跑的距离短，和