备课素材：限制酶的选择 第一学期高中生物学选择性必修三

限制酶的选择先看一道试题：为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9kb(1kb=1000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

和

两种不同限制酶的识别序列。答案：PvｕⅡ、

EcoRⅠ重点解析：KpnⅠ在载体上有两个切割点，若使用会导致酶切后形成的重组载体中终止子缺失或启动子和复制原点同时缺失，故排除。此题考查了基因工程限制酶的选择。那么，如何选择限制酶？限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低，很难分离定性；然而在有的菌株中，酶含量极高．如E.coli的pMB4(EcoRI酶）和H.aegyptius(HalⅢ酶）就是高产酶菌株。据报道从10g的H.aegyptius的细胞中，能分离提纯出可消化10gλ噬菌体DNA的酶量。细菌是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大；反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此，I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoRI、BamHI、HindⅡ、HindⅢ等。其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoRI、BamHI、Hind等），因而可形成黏性末端，另一些Ⅱ类酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"SmaI等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。AluI的切割位点如下：5'-AG^CT-3'3'-TC^GA-5'在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序已被测定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，这种酶称为“异源同功酶”（isochizomer，同切限制内切酶；同裂酶）。应该注意的是，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们的切点并不完全一样。例如XmaI和SmaI都识别六核苷酸CCCGGG，但XmaI的切点在CCCCGGG，而EmaI的切点则在CCCGGGG，前者切割DNA分子，形成带有CCGG粘性末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端（而叫平末端）。当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如HapⅡ、HpaⅡ、MnoI，都在识别顺序CCGG内有一相同的切点，HalⅢ和BsuRI同样在识别顺序GGCC内有一相同的切点。酶切位点在目的基因两侧和载体上必须都存在当实验需要构建基因表达载体时，目的基因的序列是不能被破坏的。因此所选限制酶的酶切位点应该在目的基因两侧，而不能位于目的基因内部，否则会将目的基因切断导致实验失败。此外，在载体上同样需要有一致的酶切位点，使后续DNA连接能正常进行。如果目的基因两侧无法形成相应序列，可在两侧添加与载体上酶切位点相匹配的限制酶识别序列。酶切不能破坏载体的复制原点、启动子及终止子等特殊序列在构建重组载体时，载体上的复制原点不能被破坏，否则目的基因导入受体细胞后不能正常进行DNA复制，也难以稳定存在。构建基因表达载体的最终目的是使目的基因能够表达其遗传特性，从而发挥作用，因此，启动子及终止子也不能被剪切破坏。例1、为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用酶切割S基因的cDNA和载体。答案

XbaI

和HindⅢ解析：若选择BamHI,会破坏S基因，故排除；若选择EcoRI,虽然能成功将S基因导入质粒，但可能会反向接入，使S基因不能正常表达。S基因所在序列左侧为5'端，右侧为3'端，转录方向为从左至右。选用XbaI和HindⅢ进行双酶切，能