厌氧氨氧化菌的细胞结构

厌氧氨氧化菌的细胞结构

1应用硝化反硝化技术的新型处理工艺20世纪60年代以来，随着人口的增加和工业的发展，富营养化问题日益突出。除氮和磷是城市污水厂的传统处理方法，通常采用生物法。传统生物脱氮通常采用的是硝化-反硝化工艺.所谓硝化是指利用好氧硝化细菌将氨(NH4+)转化为硝酸盐(NO3-)的过程,主要由两类微生物来完成:(1)氨氧化菌(AOB)将氨氧化为亚硝酸盐(NO2-);(2)亚硝酸盐氧化菌(NOB)将亚硝酸盐氧化为硝酸盐.后续的反硝化是指利用异养反硝化菌将硝化产物硝酸盐转化为无害氮气的过程,即实现氮素从水相转移到气相,达到去除污/废水中氨氮的目的.然而,传统的生物脱氮工艺已经日益呈现出其不可持续的特点:首先,为了将氨氮转化为硝氮,需要提供氧气,耗费大量电能;其次,城市污水中的碳源(有机物)往往不足,为提供反硝化过程所需足够的碳源,往往需要外投碳源(如甲醇或乙酸等),这提高了运行成本,同时也增加了CO2排放量.就此,环境工程师们尝试各种方法来使未来的脱氮工艺更具可持续性.其中一种改进的脱氮途径是基于亚硝酸盐的短程硝化反硝化(short-cutnitrification-denitrification)技术(PengandZhu,2006),即把硝化过程控制在亚硝酸盐阶段,阻止其进一步氧化为硝酸盐,然后利用异养反硝化菌进行反硝化.如此,较传统全程硝化反硝化工艺,硝化和反硝化过程均缩短了一个步骤,理论上能节约25%的氧气量和40%的碳源.20世纪90年代,荷兰的Mulder和Kuenen等发现了一种新型细菌———厌氧氨氧化菌(AnAOB)(Mulderetal.,1995;Strousetal.,1999a;Kuenen,2008),这类微生物可在缺氧条件下以亚硝酸盐作为电子受体将氨氧化为氮气.该细菌的发现很快引起水处理工程师们的热切关注和兴趣.污废水中的氮多以氨氮形式存在(大部分有机氮可在好氧或厌氧条件下被异养菌降解转化为氨氮),为提供AnAOB所需的亚硝酸盐,需前置短程硝化(partialnitrification),利用AOB将进水中约一半的氨转化为亚硝酸盐,然后AnAOB可将剩余的氨和AOB产生的亚硝酸盐结合生成氮气.与传统硝化反硝化工艺相比,这种基于厌氧氨氧化的脱氮工艺理论上能节约62.5%的氧气量,无需碳源,并且产生更少的剩余污泥(自养菌生长缓慢),排放更少的CO2(自养菌以CO2作为碳源),是一种更具可持续特征的脱氮工艺.2厌氧微生物的生物特性biochalianmechistic2.1anaod的发现1986年,GistBrocade发酵公司(荷兰)的Mulder发现在密封且厌氧运行的脱氮流化床中氨和硝酸盐浓度同步降低,并伴有氮气的产生.而传统观点认为氨在无氧条件下不能被生物降解,因此Mulder认为这可能是一种新的氮素转化途径,并将该过程命名为“厌氧氨氧化”(ANaerobicAMMoniumOXidation,缩写为ANAMMOX)(Mulderetal.,1995).随后vandeGraaf等证明厌氧氨氧化过程是一个生物反应,推测出其实际的电子受体是亚硝酸盐而非之前假设的硝酸盐(vandeGraafetal.,1995),并用流化床反应器成功富集了之后被称为厌氧氨氧化菌(AnAOB)的细菌(vandeGraafetal.,1996).之后,微生物学家们试图对AnAOB进行纯培养,但均告失败.1999年,Strous等(1999a)在《Nature》上首次报道采用密度梯度离心法(densitygradientcentrifugation)成功分离了AnAOB菌株,他们又通过16SrRNA基因测序,确认了AnAOB是浮霉菌门(Planctomycetes)的成员,这一报道标志着AnAOB已经获得世界范围内的认可.AnAOB的发现引起了广泛轰动,主要有3方面的意义:(1)AnAOB独特的细胞结构和代谢能力引起了微生物学家的兴趣.作为浮霉菌的成员,AnAOB具有不同于普通原核细胞的超微(内部)结构(FuerstandSagulenko,2011).另外,AnAOB如何在缺氧条件下将惰性的氨氧化也是微生物学家最感兴趣的问题(Kartaletal.,2011,2013);(2)AnAOB的发现补充了人们对自然界氮循环(图1)的认识.过去普遍认为,大气中的氮气仅来自反硝化菌;而如今海洋学家的研究表明,海洋中约一半的氮损失可能是缘于AnAOB的作用(Arrigo,2005;LamandKuypers,2011),说明厌氧氨氧化是与反硝化同等重要的过程.(3)AnAOB引起了水处理工作者的重视.厌氧氨氧化与短程硝化联用,可用于去除废水中的氨氮.较传统的硝化反硝化脱氮技术,具有能耗低、无需外投碳源和剩余污泥产量低等优点.2.2u3000黄粱梦菌的富集和合成代谢AnAOB是严格厌氧的自养菌,生长非常缓慢,为从环境样品(如污水厂污泥)中富集AnAOB,需为它提供基质氨和亚硝酸盐,以及无机碳酸氢盐作为其碳源(vandeGraafetal.,1996).应注意的是,虽然亚硝酸盐是AnAOB的基质,高浓度的亚硝酸盐却会对AnAOB产生明显的抑制作用,因此应尽量使其保持在较低浓度范围内.目前实验室多采用序批式反应器(SBR)来富集AnAOB(Strousetal.,1998),当污泥开始慢慢变为红色时,则说明富集成功.除了SBR,人们用上流式厌氧污泥床(UASB)(Imajoetal.,2004;Nietal.,2010;Schmidtetal.,2004)、生物转盘(Rotatingbiologicalcontactor,RBC)(Eglietal.,2001)等反应器也成功富集了AnAOB.Strous等(1998)基于稳定运行的SBR获得了AnAOB的生长方程式:式中,实际上包括分解和合成代谢两部分(见式(2)~(3)):(1)分解(产能)代谢:电子供体氨与电子受体亚硝酸盐以1∶1的比例反应生成氮气和水(途经一氧化氮和联氨两种中间产物),并将反应释放的能量以ATP的形式储存起来;(2)合成代谢:以亚硝酸盐作为电子供体提供还原力,利用CO2作为碳源(前体物)以及分解代谢过程提供的ATP来合成细胞物质,并产生少量硝酸盐.值得注意的是,厌氧氨氧化的终产物N2的两个氮原子一个来自NH4+,另一个来自NO2-.也就是说,当以15N标记其中一个底物(NH4+或NO2-)时,反应后将得到混合标记的N2(14N15N).而与AnAOB不同,反硝化菌反硝化产生的N2的两个N原子均来自NO3-或NO2-.因此通过质谱(massspectrometry)(vandeGraafetal.,1997)分析N2的同位素组成(14N14N,14N15N,15N15N),可将AnAOB与反硝化菌区分开来.2.3anammoxida截至目前,共发现5属(genera)10种(species)的AnAOB,均归为细菌域(Bacteria)浮霉菌门(Planctomycetes)的Brocadiales(目名,中文译名未定).5个属分别如下:(1)Brocadia(Strousetal.,1999a;Kartaletal.,2008;Oshikietal.,2011),以AnAOB的发现地———荷兰代尔夫特市的GistBrocades酵母厂命名,3个种分别为B.anammoxidans,B.fulgida和B.sinica,其中B.anammoxidans是最早被富集和分离的AnAOB;(2)Kuenenia(Strousetal.,2006),以微生物学家JohannesGijsbrechtKuenen命名,代表种为K.stuttgartiensis;(3)Anammoxoglobus(Kartaletal.,2007b),一个种A.propionicus;(4)Jettenia(Quanetal.,2008;Huetal.,2011),以微生物学家MikeS.M.Jetten命名,一个种J.asiatica;(5)Scalindua(Schmidetal.,2003;Woebkenetal.,2008;vandeVossenbergetal.,2013),4个种分别为S.brodae,S.sorokinii,S.wagneri和S.profunda.2.4被膜麻黄液AnAOB为球菌,平均直径介于800nm到1100nm之间.由于胞内大量合成的细胞色素,AnAOB细胞总体呈现红色,根据环境条件的不同,它们可独立或群体生长.AnAOB生长非常缓慢,倍增时间为7~22d(Kartaletal.,2013),目前还无法纯培养,但可通过物理纯化方法,如密度梯度离心法(densitygradientcentrifugation)(Strousetal.,1999a)分离AnAOB(99.6%,每200个细胞仅含1个污染细胞).现已证实,AnAOB以二分裂方式进行增殖,而不是早期研究所认为的出芽生殖,而其他浮霉菌的增殖方式为芽殖.浮霉菌的细胞壁结构不同于普通的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,其主要成分是蛋白质,不含肽聚糖,且其外侧未被膜包围;而革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖层外面还有一层外膜(outermembrane).更重要的是,浮霉菌的胞内结构较普通原核细胞要复杂,它们的细胞质都被膜分隔为几个区室(图2a)(Lindsayetal.,2001),呈现出真核细胞的特征.AnAOB也不例外,其细胞被膜分隔为3个区室(图2b),从外到里分别为:(1)外室细胞质(paryphoplasm),(2)核糖细胞质(riboplasm)和(3)厌氧氨氧化体(anammoxosome).研究者们提出,AnAOB的细胞壁很可能具有与其他浮霉菌类似的结构.因此,AnAOB细胞最外面的膜一般被认定为细胞质膜,且其最外面的两层膜包裹的区域是细胞质的一个区域(图2b),称为外室细胞质.然而,对K.stuttgartiensis的宏基因组分析结果表明,AnAOB含有编码周质外膜蛋白质的基因和合成肽聚糖所需的部分基因(Strousetal.,2006),表明AnAOB可能具有与普通革兰氏阴性菌类似的细胞壁结构.如此一来,外室细胞质则为一种特殊的周质.核糖细胞质相当于普通细菌的细胞质,含有拟核和核糖体,是基因转录和翻译的场所.但AnAOB是如何将合成的蛋白质运输到外室细胞质和厌氧氨氧化体,目前仍不清楚.另外,在核糖细胞质内发现储存有糖原(葡萄糖的聚合物);而在两种AnAOB“CandidatusBrocadiafulgida”和“CandidatusAnammoxoglobuspropionicus”的核糖细胞质中还发现有类似于聚羟基脂肪酸酯(PHA)或聚磷酸盐(polyP)的颗粒物(vanNiftriketal.,2008).这些细胞内含物的具体细胞功能还不十分明确.厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化体膜包裹的密闭区域,占整个细胞超过一半的体积(图2b),其内部不同于普通的细胞质,不含有核糖体.很多实验结果均证明,厌氧氨氧化体是发生厌氧氨氧化反应(NH4++NO2-→N2+2H2O)的场所,其功能类似于真核细胞的线粒体,是AnAOB的产能部位(Niftriketal.,2004).另外,厌氧氨氧化体膜含有AnAOB特有的梯形烷脂质(ladderanelipid)(Damstéetal.,2002)(图2c),这种脂质分子使膜高度不透,可最大程度地减少代谢中间产物(如联氨,N2H4)和质子(H+)的泄漏,降低能量损耗,同时可防止联氨外泄毒害核糖细胞质.2.5no2h3催化nh2h4,nh4催化氧化nph4,路径2.虽然人们通常用相对简单的方程式来表示硝化、反硝化等生物反应,但实际上这些反应要比所列的反应式复杂,通常涉及各种中间产物的形成.例如,好氧氨氧化(NH3→NO2-)反应以NH2OH为中间产物;反硝化(NO3-→N2)反应以NO2-、NO和N2O为中间产物.因此,要解决厌氧氨氧化菌的代谢途径问题,关键是确定反应过程所涉及的中间产物.VandeGraaf等(1997)用同位素标记技术考察羟胺(NH2OH)对AnAOB的作用时发现,投加14NH4+和15NH2OH(不投加NO2-)会产生14,15N2,并且会导致有N2H4的短暂积累(图3),这说明NH2OH和N2H4很可能是厌氧氨氧化反应的中间产物.据此他们提出了最早的厌氧氨氧化反应代谢模型,该代谢模型共3步:(1)NO2-被还原为NH2OH,(2)NH2OH和NH4+缩合生成N2H4,(3)N2H4氧化为最终产物氮气(N2).其中NO2-还原为NH2OH是好氧氨氧化的第二步反应(NH2OH→NO2-)的逆反应,可能由某种亚硝酸盐还原酶催化.另外,已有文献报道,羟胺氧化还原酶(HAO)不仅能氧化NH2OH,而且能氧化N2H4到N2(Hooperetal.,1997),因此第(3)步可能是由HAO催化的.而第(2)步N2H4则由一种新的、从未发现的酶催化合成,与一氧化氮还原酶(Nor)不同,这种酶可以催化两种不同的含氮分子反应形成N—N键.然而,在K.stuttgartiensis的基因组中,未发现催化NO2-还原为NH2OH的酶编码基因存在,却发现有基因编码cd1型亚硝酸盐还原酶(NirS)(Strousetal.,2006),这种酶催化亚硝酸盐还原为一氧化氮(NO),说明NO(而非NH2OH)更可能是厌氧氨氧化的代谢中间产物.Strous等(2006)基于基因组分析和AnAOB的一些生理实验结果,提出了厌氧氨氧化代谢的修正模型(图4).该模型认为NO和N2H4是其中间产物,同样也有如下三个步骤:如图4所示,首先NO2-在亚硝酸盐还原酶(nitritereductase,NirS)的作用下被还原为NO,然后联氨合成酶(hydrazinesynthase,HZS)催化NO和NH4+缩合生成N2H4,最终N2H4在联氨脱氢酶(hydrazinedehydrogenase,HDH)的作用下转化为氮气.与其他化能自养型细菌一样,AnAOB通过化学渗透机制储存能量:N2H4氧化过程中失去的4个电子经过可溶性细胞色素c、泛醌(辅酶Q)、细胞色素bc1复合体(复合体Ⅲ)、可溶性细胞色素c,最终传递到亚硝酸盐还原酶(1个电子)和联氨合成酶(3个电子).电子转移过程中所释放的能量可用于将质子(H+)由核糖细胞质移位至厌氧氨氧化体(图4),在厌氧氨氧化体膜两侧形成质子电化学梯度(electrochemicalprotongradient)(包括浓度梯度△pH和电位梯度△Ψ).这样,电子转移所释放的大部分能量得以储存起来.然后膜内侧的质子通过ATP酶自发地回流至核糖细胞质侧,并在核糖细胞质侧驱动ADP与Pi合成ATP.不久前,Kartal等(2011)验证了该代谢模型,并对投加NH2OH导致N2H4短暂积累的实验现象(图3)作出了解释:联氨脱氢酶(HDH)(kustc0694)活性会被NH2OH(或NO)抑制,为应对这种胁迫影响,AnAOB体内的另一种酶(kustc1061)可将NH2OH转化为NO,继而又与NH4+合成N2H4(0~200min).从图3可以看出,当NH2OH被完全转化后(约200min处),联氨脱氢酶所受的抑制解除,积累的N2H4浓度快速降低(200min后),说明N2H4已被转化为N2.2.6氧化影响因子影响厌氧氨氧化菌活性的环境因素很多,本文重点介绍基质与产物、溶解氧及有机物的影响作用.(1)基质和产物(氨、亚硝酸盐和硝酸盐).一般认为,AnAOB能够耐受较高浓度的氨氮和硝酸盐,但高浓度的亚硝酸盐对它的抑制非常明显.Strous等(1999b)的实验表明,AnAOB的活性在低于1g·L-1(以N计,下同)的氨和硝酸盐浓度下不会被抑制,但是亚硝酸盐浓度为0.1g·L-1时即可完全抑制厌氧氨氧化过程,而加入微量的NH2OH或N2H4可以使其恢复活性(其确切机制有待研究).DapenaMora等(2007)发现25mmol·L-1(350mg·L-1)的亚硝酸盐可以使厌氧氨氧化活性降低50%,而浓度分别为55mmol·L-1(770mg·L-1)和45mmol·L-1(630mg·L-1)的氨和硝酸盐同样也导致50%的活性丧失.(2)溶解氧.AnAOB是严格厌氧菌,因此其活性易被溶解氧(DO)所抑制.研究表明,氧气分压为0.5%空气饱和时,氨和亚硝酸盐的转化完全停止;充入氩气排除反应器内的氧气后,厌氧氨氧化活性恢复(Strousetal.,1997).厌氧氨氧化被低浓度氧气可逆性抑制的这种特性说明:理论上可通过间歇曝气方式在单个反应器内同时进行短程硝化和厌氧氨氧化.(3)有机物.很多研究均表明,有机物的存在对AnAOB的生长有着不利影响.反硝化反应会释放出比厌氧氨氧化反应更高的自由能,且反硝化菌的生长速率要远大于AnAOB,因而存在一定量有机物的条件下,AnAOB将难以与反硝化菌竞争亚硝酸盐.Molinuevo等(2009)在研究两种经预处理(消化和部分氧化)的养猪废水时发现:反应器进水COD为95mg·L-1和121mg·L-1时,氨氮仍可得到高效去除,但随着进水COD的增加会使得厌氧氨氧化过程受到不利影响,而异养反硝化菌活性得到提高;当COD分别达到237mg·L-1和290mg·L-1时,氨的去除完全停止.Tang等(2010)发现当进水COD/NO2--N为2.92时,厌氧氨氧化菌受到抑制,而异养反硝化菌成为优势菌种,在此条件下长期运行反应器会使厌氧氨氧化脱氮性能难以恢复.有趣的是,之前被认为是严格自养的AnAOB能将一些有机物,如甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐等,氧化为CO2和水(Kartaletal.,2007b,2008),但是有机物仅被异化分解,并未被同化为细胞物质.这种情况下,AnAOB可利用NO2-或者NO3-作为电子受体(Kartaletal.,2007a),利用上述有机物,将其还原为NH4+(异化性硝酸盐还原),得到的NH4+将与NO2-一同通过典型的厌氧氨氧化反应生成氮气和水(图5).3厌氧氨基氧化过程干旱处理3.1亚硝酸盐的积累污废水中氮大多以氨氮形式存在,而厌氧氨氧化菌的基质除了氨以外,还有亚硝酸盐,因此厌氧氨氧化通常需与短程硝化联用,以达到去除废水中氨氮的目的.AOB和NOB在自然或人工环境中通常呈共生关系;且在硝化反应的两个步骤中,氨氧化(NH4+→NO2-)通常是限速步骤(反应速率较慢的一步).因此,氨氧化反应产生的亚硝酸盐通常很快被转化为硝酸盐,难以积累.尽管如此,在一些特定环境条件下,仍可观察到亚硝酸盐的积累.短程硝化即通过人为控制一些环境因素,改变AOB和NOB的生长动力学,当NOB较AOB受到更强的活性抑制时,即可阻止亚硝酸盐被进一步氧化,实现亚硝酸盐的积累.目前主要采用以下3种方式来实现短程硝化:(1)提高游离氨(FreeAmmonia,FA)浓度.AOB与NOB均会被FA(NH3)所抑制,但FA对NOB的抑制更显著.因此在较高浓度的游离氨环境下可以实现亚硝酸盐的积累(Anthonisenetal.,1976).游离氨浓度与进水总氨(TAN)浓度、pH和温度(T)有关,可用式(8)计算:(2)超过25℃的操作温度.根据阿伦尼乌斯公式k=Ae-Ea/RT,在不超过酶变性的温度条件下,微生物的活性随温度的升高而增强,但不同反应的反应速率对温度的敏感性不同.氨氧化反应的活化能Ea(60~72kJ·mol-1)比亚硝酸盐氧化反应的活化能Ea(43~47kJ·mol-1)要大(VanHulleetal.,2010),因此氨氧化反应速率对温度更敏感,以致在较高温度(但低于酶变性温度)条件下,AOB生长得比NOB快.(3)降低溶解氧.低溶解氧导致的亚硝酸盐积累一般解释为AOB比NOB对氧气的亲和力(以半饱和常数KO表征)要大,因此在低氧条件下,NOB将难以与AOB竞争有限的氧气,致使亚硝酸盐氧化步骤受到抑制(Wiesmann,1994).Picioreanu等(1997)在生物膜系统中考察不同浓度的溶解氧对亚硝酸盐积累的影响(图6)时发现,当溶解氧浓度大于2.5mg·L-1时,几乎所有氨氮都转化为硝酸盐;溶解氧浓度为1.5mg·L-1左右时,可以实现最大程度的亚硝酸盐积累,但同时也有相当一部分亚硝酸盐被继续转化成为硝酸盐.可见,仅依赖于溶解氧的限制可能不足以实现完全意义的短程硝化.为进一步限制亚硝酸盐的转化,可以向系统中引入反硝化菌,这样NOB除了要与AOB争夺氧气外,还要与反硝化菌争夺亚硝酸盐,因而难以在系统中存在.在后文中将介绍将AnAOB引入反应器可达到同样的效果(淘汰NOB),而这正是CANON工艺得以实现的一个重要原因.3.2处理工艺和生物样品在厌氧氨氧化工程化应用之初,人们把短程硝化和厌氧氨氧化置于两个反应器内进行,如SHARON-ANAMMOX工艺(VanderStaretal.,2007).SHARON反应器中AOB先将进水中约一半的氨转化为亚硝酸盐,产生1∶1的NH4+∶NO2-出水进入ANAMMOX反应器,ANAMMOX反应器中的AnAOB再将氨和亚硝酸盐转化为氮气和少量的硝酸盐.出水的硝酸盐浓度较低,一般可达到排放标准要求.后来,人们发现上述两个过程也可以整合于一个反应器内进行.需要说明的是,文献中有以下3种名称命名该过程:OLAND(OxygenLimitedAerobicNitrification-Denitrification)(KuaiandVerstraete,1998)、DEMON(aerobicanoxicdeammonification)(Hippenetal.,1997)和CANON(CompletelyAutotrophicNitrogenremovalOverNitrite)(Sliekersetal.,2002).由于距AnAOB报道时间并不长,研究者们提出前两个名称时还未认识到该过程有AnAOB的参与,误以为反应器的脱氮效果是Nitrosomonas(AOB)的反硝化作用(见2.4节)导致的.本文采用第3个名称(即CANON)来描述一段式的厌氧氨氧化工艺.一般来说,CANON工艺指的是在单个反应器内限制曝气条件下,利用好氧氨氧化菌(AOB)和厌氧氨氧化菌(AnAOB)的协同作用来去除废水中的氨氮.CANON工艺之所以采用限制曝气,一是因为AOB相比NOB在低氧条件下能较好地生长,二是因为AnAOB是严格的厌氧菌,需要AOB消耗掉几乎所有的溶解氧.从生态位角度来看,AOB通常位于污泥(如颗粒污泥或生物膜)外层,消耗氧气防止其毒害污泥絮体内层的AnAOB.也就是说,虽然反应器通入了一定量的氧气,但由于传质限制原因,AnAOB所在的微环境实际上呈缺氧状态(图7a左图).从这个意义上说,CANON工艺的实现机理与同步硝化反硝化(SimultaneousNitrificationandDenitrification,SND)非常类似.Nielsen等(2005)和Vázquez-Padín等(2010)各自结合荧光原位杂交(FISH,利用带有荧光染料的核酸探针标记污泥内不同的微生物)和微电极(检测污泥内部的氧气和亚硝酸盐浓度梯度)两种技术很好地证实了CANON颗粒污泥的分层现象.然而,Vlaeminck等(2010)的研究表明,一些CANON反应器内的颗粒污泥并没有明显的种群分层现象,而另一些反应器内的颗粒污泥则确实有分层现象,这一结果说明,不同CANON反应器获得的厌氧氨氧化污泥可能会呈现不同种群分布特性.由于AOB产生了NOB的基质亚硝酸盐,所以NOB在CANON系统中是可能生长繁殖的.CANON反应器运行过程中应特别注意防止NOB中的增殖,否则反应器的脱氮效果将受到严重影响.NOB难以在正常运行的CANON系统内占一席之地,主要有以下几个方面的原因:(1)基质竞争.CANON反应器中氧气和亚硝酸盐都处于较低的浓度范围,NOB既要与AOB争夺氧气,又要与AnAOB争夺亚硝酸盐,受到双重竞争压力.(2)游离氨的选择性抑制.目前CANON工艺一般用于处理高氨氮废水,如污泥消化上清液和垃圾渗滤液等.当进水游离氨浓度较高时,NOB的活性和生长将受到比AOB和AnAOB更强的抑制.(3)高温.目前CANON反应器的操作温度多为30~35℃,在如此高温条件下,AOB比NOB生长更快(见2.1节),同时该温度范围也接近AnAOB的最佳生长温度.Strous等(1999)计算得出AnAOB的活化能为70kJ·mol-1,与AOB接近而大于NOB,说明较高的温度更有利于AOB和AnAOB在CANON反应器内的生存.总的来说,可采用两种方法来快速启动CANON反应器:一种方法是往厌氧氨氧化反应器接种硝化污泥并通入空气保持微氧条件,同时可将进水基质从含氨氮和亚硝酸盐两种成分转变为仅含氨氮(Thirdetal.,2001);另一种方法是往低氧操作的短程硝化反应器接种厌氧氨氧化污泥(Pynaertetal.,2004).研究表明,第一种方法一般会导致厌氧氨氧化活性的大幅降低,而第二种启动方式更为有效.该启动方法仅需少量的AnAOB接种物,同时较高的硝化活性可避免AnAOB受到氧气的毒害;通常经过1到2个月的驯化,厌氧氨氧化的活性逐步提高,从而可达到快速启动CANON反应器的目的.3.3关于乌拉工艺的管理和维护3.3.1处理工艺中nb的生长一般来说,过量曝气将导致CANON反应器内的溶解氧上升并使NOB的增殖成为可能.Joss等(2011)考察了瑞士苏黎世Zurich-Werdholzli污水处理厂(WWTP)同时运行着的南北两个平行的1400m3的CANON反应器,它们的进水和运行参数基本相同,唯一的不同是:北边反应器配备的是新的曝气设备,而南边反应器的曝气设备的膜已旧,需每2周清洗1次,每次清洗导致2h的过量曝气.在此期间,氧气的供给速率大大超过了AOB对氧气的消耗速率,从而造成了对AnAOB活性的抑制,亚硝酸盐也开始积累.氧气和亚硝酸盐浓度同时升高使得NOB的生长成为可能.最终,南边CANON反应器出水硝酸盐浓度从低于15mg·L-1(2009年6月底)升高为超过200mg·L-1(2009年10月中旬),说明NOB已在反应器内大量增殖.另一方面,保持CANON反应器运行过程中较好的AOB氨氧化活性至关重要.当进水氨氮负荷波动或一些有毒物质进入反应器致使AOB活性下降时,(1)如果此时曝气量仍保持不变,反应器内溶解氧将会上升,并可能导致AnAOB活性的抑制,从而破坏CANON工艺的稳定性(图7b).Third等(2001)将进水氨氮浓度从12mmol·L-1降为5.2mmol·L-1运行超过1个月后,发现增殖出一定数量的NOB,而CANON反应器的脱氮率也从92%下降到57%.这说明基质限制导致氨氧化速率降低,继而使得反应器内的溶解氧过剩,造成对AnAOB活性的抑制.污水厂可通过配置溶解氧控制器来解决这个问题:当进水氨氮浓度下降时,控制气泵的空气流量防止水中溶解氧的提高,使NOB难以有生存的空间.(2)另一方面,AnAOB实际接触到的氧气多少不仅与水相溶解氧有关,还与群居于污泥外层的AOB的耗氧速率有关.换句话说,即便通过降低曝气量使反应器内的溶解氧维持在之前的水平,也无法完全确保CANON工艺的脱氮效果.Joss等(2011)发现,在CANON反应器正常运行时,溶解氧为0.2mg·L-1时可维持厌氧氨氧化脱氮效果良好;但若AOB的活性被部分抑制,同样的溶解氧浓度(0.2mg·L-1)却完全抑制了厌氧氨氧化过程,导致了亚硝酸盐的积累,从而促成了有利于NOB增殖的环境条件(图7b).为此他们提出,为防止NOB的增殖,曝气量应根据亚硝酸盐浓度而非溶解氧浓度来调控:当亚硝酸盐浓度大于2mg(NO2--N)·L-1时,即说明曝气量过高.尽管如此,由于目前溶解氧更方便在线检测,且多数情况下能反映工艺的稳定性,溶解氧仍是CANON工艺最重要的控制工况.3.3.2连续曝气工艺优化及脱氮速率由于AnAOB对氧气呈可逆性抑制特征,因此间歇曝气方式同样可以实现一段式的自养脱氮.Third等(2005)利用活性污泥在14周内成功富集了AnAOB(污泥为浅棕色絮体,平均直径<50μm),接种硝化污泥并对反应器实施了低曝气量(<8mL·min-1空气)的连续曝气,发现AnAOB的活性被完全抑制.究其原因,可能是因为:与具有明显分层的颗粒污泥不同,絮状污泥对氧气的传质(扩散)限制作用相对不足,因而曝气量的控制更为困难.为此,他们将连续曝气改为间歇曝气,结果成功启动了CANON工艺.优化后采用20min充氧(8mL·min-1空气)和30min排氧(8mL·min-1N2/CO2)的周期性运行,脱氮速率(NitrogenRemovalRate,NRR)稳定在0.08kg·m-3·d-1.脱氮速率较低主要有两个原因:一是相比颗粒污泥的CANON反应器,絮体的生物量相对不足;二是对于间歇曝气的运行方式,无论是好氧段还是缺氧段,都只有其中的一种微生物(AOB或AnAOB)具有活性.3.3.3nob增殖情况的监测NOB的增殖是导致CANON反应器崩溃的主要原因.对于运行良好的CANON反应器,被去除的12%左右的氨氮会转化为硝酸盐(不考虑反硝化作用);如果出水硝酸盐浓度明显超过该比例,则说明污泥内可能已存在一定数量的NOB种群.而对于已存在大量NOB种群的情况,目前一般只能通过排泥并接种其他CANON反应器的污泥来恢复(Jossetal.,2011).因此,对NOB的增殖情况进行监测和控制十分关键.以下3种方法可用于对NOB的增殖情况进行监测:(1)活性测试(activitytest)(Sliekersetal.,2002),(2)FISH,(3)定量PCR(qPCR)(Pelliceretal.,2010).其中活性测试是一种非原位的、通过测量NOB的最大比活性来间接表示NOB种群生长情况的方法.因此与之相比,基于分子生物学技术的监测结果更具说服力.相比检测限仅为2%~5%生物量且不能绝对定量的FISH技术,定量PCR(qPCR)能更及时准确地监测NOB的增殖情况,在NOB丰度较低时即可尽早发现NOB的异常增殖状况(Jossetal.,2011).由于NOB的衰减速率(decayrate)很慢,如果不对CANON工艺进行排泥,将很难降低污泥内的NOB丰度.反之,曝气量的调节(保证出水硝酸盐浓度较低)配合适当的排泥(即污泥龄控制)能有效地将NOB淘洗出系统(Jossetal.,2011).3.4工艺第二、二段式的路径aodN2O是一种强温室气体,其全球增温潜势(GlobalWarmingPotential,GWP)约为CO2的310倍(Houghtonetal.,2001).尽管目前认为AnAOB不具有产生N2O的途径(Kartaletal.,2007a),厌氧氨氧化工艺却会释放出比常规反硝化脱氮工艺更多的N2O,其主要来源是AOB的硝化菌反硝化(nitrifierdenitrification)作用.研究表明,AOB不仅能表达氨氧化所需要的酶,而且还能表达部分反硝化酶———亚硝酸盐还原酶(Nir)和一氧化氮还原酶(Nor),致使氨氧化产生的NO2-可被进一步还原为NO和N2O(Wrageetal.,2001).Kester等(1997)发现Nitrosomonaseuropaea(AOB)纯培养物在低溶解氧条件下会产生较多的N2O和NO,但是将其与Nitrobacterwinogradskyi(NOB)共同培养时,NO和N2O的释放量大大减少,说明亚硝酸盐是否积累对AOB产生的N2O量有较大影响.表1总结了文献报道的一段式和二段式厌氧氨氧化工艺N2O的释放情况.可以看出,一段式比二段式的N2O释放