谷胱甘肽硫转移酶1c-1c中的ser-ser-sec模拟酶的制备及性质研究

谷胱甘肽硫转移酶1c-1c中的ser-ser-sec模拟酶的制备及性质研究

谷胱甘醇氧化酶（pgx）是一种重要的氧化酶，与身体氧化损伤中的重要作用有关。gdpx与细胞生长、信号转导、死亡、缺氧、脉象硬化、炎症等正常生理和病理过程有关。由于身体中缺乏gdpx，许多疾病（如免疫反应障碍、糖尿病、心血管疾病和癌症）和其他疾病（4.6）影响了药物在医疗领域的应用。因此，研究人员转向研究gdpx模型物质。理想的psx模拟需要两个条件。（1）引入芳基sec。（2）在此基础上，能够识别和结合gsh的分子，并在此基础上进行化学修养或互补基因工程，以获得具有高gdpx动态的模拟酶[9、11、12、13、14、15、16]。人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶(hGSTZ1c-1c)是人体内一类重要的解毒酶,具有天然GSH结合部位其活性中心是由3个保守的Ser14-Ser15-Cys16残基组成的SSC基序.该基序在空间位置上靠近GSH的巯基,且结构稳定,因此hGSTZ1c-1c被视为模拟GPx的理想骨架蛋白.Zheng等通过化学修饰的方法制备了具有较高活力的GPx模拟酶,但由于反应条件剧烈,导致含硒蛋白的收率很低.Yin等利用真核表达系统获得了具有较高GPx活力的Se-hGST1-1,并且通过计算机辅助模拟分析了蛋白结构与催化活力间的关系,但仍无法克服含硒蛋白产率低的缺点.此外,Yu等利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌表达系统结合定点突变将Sec-14和Sec-15引入到hGSTZ1c-1c中,获得了多株含硒GST蛋白酶.然而,该表达系统会将目标蛋白的所有Cys都转变为Sec,这种非预期的转变对蛋白结构产生了很大影响,进而影响其催化活性.利用Cys与Ser在结构和性质上的相似性,本研究首先把hGSTZ1c-1c非催化中心的4个Cys突变为Ser,结合前期对含硒hGST1-1的理论预测结果,通过定点突变在催化中心的特定位点引入Sec,以期获得具有GPx活力的模拟酶,并研究了其催化活性的变化规律1实验部分1.1hgstz1c-1c基因回复突变体partE.coliDH5α和BL21(DE3)工程菌株由本室保存;BL21(DE3)cys半胱氨酸缺陷型大肠杆菌菌株(Kanar)由德国慕尼黑大学AugustB9ck教授及法国蒙彼利埃第一大学Marie-PauleStrub惠赠;含hGSTZ1c-1c基因的pQEZ1(Ampr)质粒由澳大利亚BoardP.G.教授惠赠;pColdⅠ质粒和限制性内切酶购自Takara公司;突变PCR引物由上海生物工程有限公司合成;快速定点突变试剂盒购于Stratagen公司;分离纯化介质购于PharmaciaBiotech公司;鼠抗多聚组氨酸标签(His-Tag)单克隆抗体购于Sigma公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠多克隆抗体购于SantaCruz公司;其它化学试剂均为国产分析纯.1.2突变株的构建突变PCR反应体系及反应条件参见快速定点突变试剂盒说明书,向突变PCR产物中加入DpnⅠ酶,于37℃酶切16h.将酶切产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中.挑取阳性单克隆测序鉴定,保留突变成功的菌株.1.3核心蛋白的制备将pColdⅠ-hGSTZ1c-1cSer及其突变体质粒转化到BL21(DE3)cys感受态细胞中,筛选阳性克隆参照文献方法制备含硒蛋白及非含硒蛋白.按ChelatingSepharoseFastFlow说明书纯化蛋白,透析除盐,获得目标蛋白.1.4相对分子量测定参照文献方法对纯化后的蛋白进行SDS检测和WesternBlot分析.利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分别测定hGSTZ1c-1cSer-14C/15C和seleno-hGSTZ1c-1cSer-14C/15C的相对分子量,计算出每分子蛋白的硒含量,进而分析含硒蛋白中Se的取代率.1.6gst活力的测定采用Wilson酶偶联法测定蛋白的GPx活力.酶活力定义为37℃下每分钟氧化1μmolNADPH所需酶的量.比活单位表示为U/μmol.以氯氟乙酸(CFA)为底物检测蛋白GST活力.反应体系及具体方法参照文献,活力单位用比活表示为μmol·min-1·mg-1.2结果与讨论2.1pse及gst活性将hGSTZ1c-1c非催化中心的Cys-137,Cys-154,Cys-165和Cys-205突变为Ser,期望减少非特异性引入的Sec对蛋白结构及性质产生的影响.在此基础上获得了S14C,S15C,S14C/S15C及S17C突变体,以期通过缺陷表达在这些特定位点引入Sec,从而获得具有GPx活力的模拟酶(图1).此外,通过改变hGSTZ1c-1c的SSC基序中的氨基酸,观察各突变体GST活力的改变,从而讨论SSC基序在催化反应中发挥的作用.2.2纯化蛋白的鉴定SDS结果[图S1(A),见本文支持信息]显示,在分子量约26700处可见明显蛋白条带,表明成功纯化了含硒和非含硒hGSTZ1c-1cSer及其突变体蛋白.WesternBlot结果显示,约26700处有阳性条带[图S1(B),见本文支持信息],进一步证实获得的纯化蛋白为目标蛋白.2.3hg-stz1c-1cser-14/15c的相对分子量和相对分子量MALDI-TOFMS测试结果显示,seleno-hGSTZ1c-1cSer-14/15C的相对分子量为26540±23,hG-STZ1c-1cSer-14/15C的相对分子量为26355±38(图S2,见本文支持信息).计算得出硒蛋白的Sec取代率约为78%.此结果表明,通过缺陷表达已将Sec引入seleno-hGSTZ1c-1cSer突变体,亦证实通过该方法获得的硒蛋白中Sec以亚硒酸态(RSeO2H)形式存在,与文献[11,15]结论相符.2.4gpx活力变化GPx活力测定结果见表2,其中seleno-hGSTZ1c-1cSer-14C/15C,-15C及-17C均显示出一定的GPx活力,比之前报道的几个相应seleno-hGSTZ1c-1c突变体的GPx活力(0~5.23U/μmol)有明显提高,更显著高于已用于临床的GPx模拟物Ebselen(0.99U/μmol),表明这些突变有利于催化反应的发生,对今后的研究具有重要的指导意义.2.5突变体pcold-hgstz1c-1c的结构及其功能含硒与非含硒hGSTZ1c-1cSer及其突变体的GST活力列于表2.由图2可见,hGSTZ1c-1cSer的GST活力较突变前下降近1/2,这可能是4个Cys向Ser的改变导致蛋白结构发生了变化,从而影响了酶的活性.虽然hGSTZ1c-1c中并不存在二硫键,但可以看出Cys在维持其结构与性质上发挥着重要作用.此外,seleno-hGSTZ1c-1cSer的GST活力高于seleno-hGSTZ1c-1c,且除seleno-hGSTZ1c-1cSer之外的含硒突变体均没有明显的GST活力.这说明与Ser取代Cys相比,Sec取代Cys对蛋白结构及性质的影响更大.因此,在利用半胱氨酸缺陷表达系统制备硒蛋白时,为保持蛋白原有结构不会发生较大变化,应尽量选择含Cys数量少的蛋白为骨架蛋白,必要时将非催化位点的Cys突变为Ser.hGSTZ1c-1c的活性中心是一个保守的SSC基序,探讨该基序中不同氨基酸残基对GST活力的贡献有助于该蛋白的开发与应用.在突变体hGSTZ1c-1cSer基础上,Ser-14和Ser-15的任何一个氨基酸残基的改变均会导致蛋白几乎丧失GST活力(图2),说明Ser-14和Ser-15对hGSTZ1c-1c的GST活力至关重要.前期研究发现,Ser-14对结合GSH及其位置的取向具有重要作用.而seleno-hGSTZ1c-1cSer-14C没有GPx活力,则可能是由于14位Ser被Sec取代后影响了酶与底物GSH的结合,导致Se原子无法与底物的S原子反应.前文利用真核表达系统定向将Ser-15转变为Sec-15,获得了一株具有GPx活力的模拟酶,而使用缺陷表达法获得的seleno-hGSTZ1c-1c-15C却不然.二者的区别在于除Sec-15外,真核系统保留了原有的Cys,而缺陷表达系统会将蛋白中Cys替换成Sec,从而对蛋白的结构及性质产生影响.用Ser取代Cys可明显减小由此对蛋白造成的负面影响,这可以由seleno-hGSTZ1c-1cSer-15C突变体具备更高的GPx活力得到证实.计算机模拟结果显示,Ser-15突变为Cys后,Cys的巯基与底物GSH的巯基之间的距离没有较大变化,但由于Ser-15的羟基被巯基替换,蛋白的GST活力几乎丧失.由此可推断,Ser-15对酶活力的贡献更倾向于催化作用,这也是seleno-hGSTZ1c-1cSer-15C具有一定GPx活力的另一个原因.由图2可见,当Ser-17突变为Cys时,其GST活力较hGSTZ1c-1cSer略有提高.这说明在hGSTZ1c-1cSer的基础上,17位的突变在一定程度上减小了由非催化中心的Cys被Ser替代所引起的蛋白结构的改变,从而有利于催化反应的进行.GPx的催化中心是一个保守的催化三联体结构(Trp,Gln和Sec),该结构的完整性在GPx催化反应中发挥着重要作用.研究结果表明,seleno-hGSTZ1c-1cSer中Sec-17是另一个潜在的GPx催化活性位点,它与Trp-18和Gln-207可以组成类似GPx催化三联体的结构,虽然该结构没有天然GPx催化三联体精妙,但Trp和Gln提供的氢键应有益于GSH与Sec之间的反应,这可能是突变体seleno-hGSTZ1c-1cSer-17C的活力高于seleno-hGSTZ1c-1cSer-15C和-14C/15C的原因.此外,由该位点突变引起的周围微环境的改变也可能对该突变体GPx活性的提高有一定的贡献.提取质粒pQEZ1并对其进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,获得的hGSTZ1c-1c基因亚克隆至pColdⅠ载体上,得到重组质粒pColdⅠ-hG