微生物限度方法学验证

Preparedon22NovemberPreparedon22November微生物程度办法学验证微生物程度检查办法学验证一、检查办法根据微生物计数法（中国药典四部1105）；控制菌检查法（中国药典四部1106）；非无菌药品微生物程度原则（中国药典四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表1菌种菌种名称菌种代数菌种状态厂家大肠埃希菌[CMCC(B)44102]3正常浙江省食品药品检查研究院金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]3正常枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]3正常白色念珠菌[CMCC(F)98001]3正常黑曲霉[CMCC(F)98003]3正常乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]3正常表2培养基培养基名称批号厂家营养肉汤培养基150222北京三药科技开发公司改良马丁培养基150134北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基150215北京三药科技开发公司营养琼脂培养基150317北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基150323北京三药科技开发公司胆盐乳糖培养基150127北京三药科技开发公司胆盐硫乳琼脂培养基150214北京三药科技开发公司四硫磺酸钠亮绿培养基150416北京三药科技开发公司MUG培养基150122北京三药科技开发公司曙红亚甲蓝琼脂培养基150137北京三药科技开发公司三糖铁琼脂培养基150207北京三药科技开发公司表3对照用培养基对照培养基名称批号厂家营养肉汤对照培养基中国食品药品检定研究院营养琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院玫瑰红钠琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院胆盐乳糖对照培养基中国食品药品检定研究院胆盐硫乳琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院四硫磺酸钠亮绿对照培养基中国食品药品检定研究院MUG对照培养基中国食品药品检定研究院曙红亚甲蓝琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院三糖铁琼脂对照培养基表4试剂试剂名称批号级别磷酸二氢钾130826分析纯氢氧化钠分析纯氯化钠分析纯聚山梨酯80化学纯95%乙醇药用级二甲氨基苯甲醛分析纯盐酸分析纯稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充足振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml渐渐滴入。三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。四、验证内容1、计数办法验证将制备好的菌悬液用%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，运用血球计数板计数，拟定具体菌悬液浓度，取靠近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选用各项实验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完毕。通过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度靠近100cfu/ml。2、合用性检查细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意本身安全），立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验，作为对照。其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不不大于对照培养基的70%。细菌、霉菌及酵母菌培养基合用性检查培养基名称菌种名称测试培养基（cfu）对照培养基（cfu）回收率(%)大小形态原则结论碟1碟2平均碟1碟2平均营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌878385959997一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定金黄色葡萄球菌888285949896一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定大肠埃希菌8386959595一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌84879994一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定金黄色葡萄球菌9086889710199一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定大肠埃希菌88839299一致大小形态一致且回收率≥70%符合规定培养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长状况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基能够精确的检测出对应微生物状况。控制菌2.2.1内含菌约营养肉汤培养基内含菌约内含菌约同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验，作为对照，2.2.22.2.3控制菌培养基合用性检查培养基名称促生长性（与对照比较）克制性（与对照比较）金黄色平葡萄球菌批示性（与对照比较）结论菌种名称形态大小形态大小批示反映无生长------符合规定--符合规定营养肉汤培养基--------符合规定--------符合规定无生长------符合规定--符合规定--符合规定--符合规定培养基的促生长性及批示性菌落生长状态一致，克制性均无菌落生长，阐明培养基合用性良好。3、抑菌性：取持续生产的三批样品进行测定细菌、霉菌、酵母菌3.1.1供试液的制备：称取本品10g，加缓冲液100ml，混匀，制成1：3.1.2实验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中，立刻倾注15～20ml温度不超出45℃溶化的营养琼脂培养基培养，每株实验菌平行制备2个平皿，菌液组：取上述各实验菌液1ml，加入对应的培养基培养，每株实验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入15～20ml温度不超出45℃溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基3.1.5以供试品对照组为样品空白(C0)、以菌液组为对照(T)、以实验组为测试品(C)计：(C-C0)/T≥70%细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测成果统计批号培养基名称菌种培养时间（h）菌液组菌数Cfu实验组菌数Cfu供试品对照组菌数回收率%数值平均数值平均数值平均150804营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72848690810728895金黄色葡萄球菌7286849372829012大肠埃希菌72849192728793玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120868485001208786金黄色葡萄球菌12087858612088870大肠埃希菌1208783831208483150805营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌7288859565728690金黄色葡萄球菌7285957284924大肠埃希菌728189728794玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120838587001208788金黄色葡萄球菌12086848812082850大肠埃希菌120888486881208090150806营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72879466728497金黄色葡萄球菌72838696967289966大肠埃希菌72859596728697玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌12084848587001208489金黄色葡萄球菌12085908912086880大肠埃希菌1208289871208585通过持续三批次不同种菌类的加样，回收率均在90%以上，阐明本产品对于细菌、霉菌及酵母菌不含有抑菌性。控制菌3.2.1取10供试液（制备办法同3.1.1）及1ml(10～100cfu)加入3.2.2取10供试液（制备办法同3.1.1）1ml(10～100cfu)合格原则若上述实验检测出实验菌，则按此供试液制备办法和控制菌检查办法进行供试品的该控制菌检查。控制菌抑菌性检查大肠埃希菌实验组（+/-）阴性对照组（+/-）MUG++--靛基质++--沙门氏菌实验组（+/-）阴性对照组（+/-）四硫磺酸钠亮绿培养基++--胆盐硫乳琼脂培养基++--曙红亚