益气养阴化瘀通络中药及其拆方对糖尿病大鼠模型nephrin蛋白的影响

益气养阴化瘀通络中药及其拆方对糖尿病大鼠模型nephrin蛋白的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病最严重的微血管并发症。这是治疗复肠疾病的常见原因之一，严重危害患者健康。白蛋白尿作为DN的标志和DN进展的独立危险因素,日益受到重视。DN白蛋白尿的出现,与肾小球滤过屏障功能受损密切相关。研究证实:nephrin从DN患者尿中丢失的增加与尿蛋白排泄增多关系密切,动物实验也发现实验性DM大鼠尿中出现nephrin蛋白。益气养阴化瘀通络中药为临床治疗DN的经验方,本实验旨在观察益气养阴化瘀通络中药及其拆方对DM大鼠模型体重、肾皮质nephrin水平(K-nephrin)、24h尿白蛋白(U-alb)、24h尿nephrin蛋白(U-nephrin)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、内生肌酐清除率(CCr)和肾脏病理形态方面的影响,初步探讨益气养阴中药配伍化瘀通络中药、化瘀中药及通络中药对DM的作用机制及作用差别,为临床用药提供依据。材料和方法1动物房温湿度健康雄性SD大鼠55只,体重120～150g(合格证编号:1008095),河北省实验动物中心提供。动物房室温(22±2)℃,湿度(55±5)%。大鼠自由进食、饮水。2黄精、类,6.3g/袋中药配方颗粒黄芪(批号:1010112,2g/袋,相当于饮片10g)、地黄(批号:1008093,2g/袋,相当于饮片10g)、黄精(批号:0905188,3g/袋,相当于饮片15g)、川芎(批号:1009086,1.3g/袋,相当于饮片6g)、丹参(批号:1010056,1.8g/袋,相当于饮片10g)、地龙(批号:1008068,1.0g/袋,相当于饮片10g)、水蛭(批号:1003119,1.5g/袋,相当于饮片3g)、全蝎(批号:1008039,1.0g/袋,相当于饮片3g),由广东一方制药有限公司惠赠。3血糖、糖化血红蛋白STZ,Sigma公司,美国;大鼠白蛋白ELISA试剂盒和大鼠nephrinELISA试剂盒,上海蓝基生物科技有限公司;Accu-Chek®Active快速血糖仪及血糖试纸,德国;NycoCard®糖化血红蛋白试剂盒及NycoCard®READERⅡ糖化血红蛋白测定仪,挪威;VERSAmax全自动酶标检测仪,美国;2135型Leica切片机,德国。4方法4.1hfd和stz的制备大鼠每笼5只,适应性饲养1周后,按体重随机分为正常对照组(N组)10只,始终给予实验动物全价颗粒饲料,热卡为351千卡/100g。高脂饲料(HFD)组45只,给予HFD,含蛋白质18.6%、脂类22.3%、糖44.4%、水10%,其余为矿物质和维生素等,热卡为436千卡/100g,由河北省实验动物中心加工成颗粒饲料。12周后,HFD组大鼠按30mg/kg一次性腹腔注射STZ。以0.1mol/LpH4.4枸橼酸缓冲液配制成1.5%溶液,30min内使用。N组注射相应体积的枸橼酸缓冲液。72h后尾静脉取血测FBG,FBG≥16.7mmol/L为DM造模成功。4.2中药颗粒的制备将成模大鼠按体重随机分为模型组(M组)、益气养阴化瘀通络中药治疗组(YHT组),由黄芪、地黄、丹参、川芎各2袋,黄精、地龙、水蛭、全蝎各1袋配方,按1.0g/kg给药;、益气养阴化瘀中药治疗组(YH组),由黄芪、地黄、丹参、川芎各2袋,黄精1袋配方,按0.92g/kg给药;益气养阴通络中药治疗组(YT组)各10只,益气养阴通络中药黄芪、地黄各2袋,黄精、地龙、水蛭、全蝎各1袋中药配方颗粒,按0.79g/kg给药。给药量按大鼠与人体型系数折算。各组中药颗粒用开水溶解后灌胃,定容至1mL/100g,每天1次,共给药32周。N组和M组灌服相应体积超纯水。过程中不给予胰岛素及其他药物干预,不定期检测尾静脉血糖,血糖缓解者予以剔除。4.3尿胱之相关指标检测肾皮质中k-alb和u-niphin的表达HFD前、FHD12周后、实验结束前称量大鼠体重。给药32周末,将大鼠单只饲养于清洁的代谢笼中,禁食不禁水,准确收集24h尿液,记录尿量,3500r/min,离心10min,取上清,-20℃保存,用于尿肌酐(UCr)、U-alb和U-nephrin的检测。尾静脉取血测定FBG和HbA1c后,水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉成功后股动脉取血,检测血清肌酐(SCr),计算CCr(mL/min)。快速取出肾脏,剥去被膜,留取光镜标本,甲醛-冰乙酸-乙醇(FAA)固定液固定。留取肾皮质,经液氮短暂冷冻后,-70℃保存备用。肾皮质匀浆测K-nephrin。K-nephrin、U-alb和U-nephrin的测定均按ELISA试剂盒说明书由专人进行操作。4.4肾组织病理学检查肾组织标本常规脱水、透明后,石蜡包埋切片,切片厚度2μm,Masson染色。显微镜下观察肾组织病理形态改变,放大400倍摄像。4.5大鼠体重变化比较采用SPSS16.0统计软件包进行分析,所有资料以x¯±sx¯±s表示,N组及HFD组大鼠体重变化比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,LSD进行两两组间比较,两者相关性分析采用一元线性相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。肾组织病理观察1一般情况注射STZ后72h内大鼠死亡2只,3只FBG<16.7mmol/L,予以剔除。M组14周时1只血糖缓解,予以剔除。YH组5周时死亡1只,YHT组15周时死亡1只,YT组6周和31周时各死亡1只。死亡原因可能与血糖高,诱发代谢紊乱,最终导致多脏器衰竭有关。2N组及HFD组大鼠体重变化情况比较(表1)N组体重成持续增加趋势,12周后HFD组体重显著增加,达初始体重的2.3倍,N组体重达初始体重的1.4倍,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。3各组大鼠灌胃32周后体重比较(表2)造模32周后,M组体重下降最多,达25%(P<0.01),YHT组体重下降最少,仅下降13%。与M组比较,各给药组体重差异均有统计学意义(P<0.01),各给药组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4各组肾组织病理形态观察(图1)N组肾小球结构清晰,未见肥大及萎缩,球囊壁光滑,细胞外基质与系膜细胞分布正常,毛细血管腔清晰,开放正常。M组大鼠肾小球明显肥大,毛细血管袢扩张,部分肾小囊腔变窄,呈裂隙状,肾小球系膜细胞增生,系膜基质明显增多,系膜区增宽。各给药组肾小球肥大不如M组明显,细胞外基质增多较M组轻。5各组大鼠FBG、HbA1c、CCr、K-nephrin比较(表3)与N组比较,M组FBG、CCr和HbA1c显著升高,分别升高了5.42倍、6.1倍和1.92倍,K-nephrin显著降低,降低了46.58%,差异有统计学意义(P<0.01)。与M组比较,各给药组(除YT组FBG和HbA1c外)相应指标明显改善(P<0.01)。YT组虽然对FBG和HbA1c影响不明显,但对CCr有明显降低作用(P<0.01),提示益气养阴通络中药保护肾功能的作用不依赖于改善糖代谢。与YHT组比较,YH组和YT组CCr差异均有统计学意义(P<0.01),提示在改善肾小球高滤过方面,化瘀药和通络药起协同作用。以YHT组K-nephrin水平最高,几乎达正常水平,与N组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。其余给药组K-nephrin也有不同程度改善,但组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6各组大鼠U-alb和U-nephrin的比较(表4)与N组比较,M组大鼠U-alb和U-nephrin显著增加,分别达N组的46倍和77倍。与M组比较,各给药组U-alb和U-nephrin显著减少(P<0.01)。以YHT组U-nephrin最低,YT组U-alb最低,但各给药组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。7M组大鼠U-alb和nephrin蛋白的相关性分析U-alb和U-nephrin两者呈正相关,直线回归方程Y=74.076+4.527X,相关系数r=0.941,P=0.017。U-alb和K-nephrin呈负相关,直线回归方程Y=134.733-42.585X,相关系数r=-0.987,P=0.002,差异均有统计学意义。其他化瘀中药及通药对dm的作用机制课题组在不断总结临床经验的基础上,结合现代中医医家对DN的认识,认为DM发展至DN,发病机制以气阴两虚为根本,瘀血阻络贯穿全程,针对病机,拟定益气养阴化瘀通络中药为治疗DN的基本用药。其中,黄芪、黄精、地黄益气养阴,丹参、川芎活血化瘀,地龙、水蛭、全蝎逐瘀通络。全方攻补兼施,扶正祛邪,切中病机,对DM显示出明显治疗效果。各给药组与M组比较,关键指标有明显改善,从一定程度上验证了气阴两虚乃DM基本病机。YHT组CCr显著改善,与YH组和YT组比较,差异显著,“以效测证”,提示长期DM瘀血络阻病变突出,对DM患者可加强化瘀通络治疗。正如仝小林等提出络脉瘀阻是DM的根结所在,治疗时主张积极运用活血通络药物。YT组CCr较之M组显著降低,提示肾小球高滤过得到显著改善,但是对FBG和HbA1c降低不明显,提示其改善肾功能不依赖于改善糖代谢,其机制有待于进一步深入研究。白蛋白尿是DN早期最主要的表现,也是DN病变程度轻重和预后判断的重要指标之一。蛋白尿的发生与肾小球的滤过屏障功能下降密切相关。裂孔隔膜蛋白——nephrin蛋白作为肾小球滤过屏障结构成分,近年来成为DN中的研究热点。薛凌宇等研究发现DN患者肾小球nephrin的表达较单纯DM组和对照组减少,认为nephrin的减少,可能影响肾小球滤过膜的通透性,从而导致大量蛋白尿的产生。KelleyDJ等利用STZ诱导SD雄性大鼠成DM大鼠,24周后,DM大鼠nephrin的表达明显减弱,尿白蛋白显著增加。可见,nephrin在DN的发生发展中具有重要作用。故本研究以此为切入点,初步探讨益气养阴中药配伍化瘀通络中药、化瘀中药及通络中药对DM的作用机制及对nephrin影响的差别,为临床用药提供依据。本实验参考相关文献,通过高脂饲料联合小剂量STZ腹腔注射成功复制DN模型,观察到模型大鼠尿中nephrin排泄增加,与AaltonenP等的报