乌梅白凤丸对肾虚血亏大鼠子宫内膜血管生成的影响及作用机制

乌梅白凤丸对肾虚血亏大鼠子宫内膜血管生成的影响及作用机制

乌艾乌沙是一种著名的妇科药物，具有很好的疗效。这本书是由明代著名的龚廷贤所著的。这本书是在《寿世宝元》一书中发表的。具有补气养血、调经止带、阴阳双补的作用,是治疗气血两虚,身体瘦弱,腰膝酸软,月经不调,崩漏带下多种病证,使用范围非常广泛。现代药理学研究表明,乌鸡白凤丸有雌激素样作用,具有促进子宫内膜修复,腺体数目增多,肌层增厚,能够调节子宫内膜分泌机能不足的现象。本实验通过制备肾虚血亏大鼠模型,探讨乌鸡白凤丸对肾虚血亏型大鼠子宫内膜血管生成影响及作用机制,将结果报道如下。1材料、试剂与仪器1.1.1药物乌鸡白凤丸购自湖南中医药大学第一附属医院,江西半边天药业生产,生产批号为120704;羟基脲片购自湖南中药大学第一附属医院,北京嘉林药业生产,生产批号为120301。1.1.2动物SD雌性大鼠(清洁级)60只,十月龄,体重250~280g;由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号为SCXK(湘)2011-0003。1.1.3试剂与仪器雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)和孕激素受体(ProgesteroneReceptor,PR)、血管内皮生长因子(Eascularendothelialgrowthfactor,VEGF)试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供,批号分别为bs-0725R,bs-0111R,bs-0279R;PG802-S型电子天平(梅特勒-托力公司,德国);MAIS医学图像分析系统(北航公司,中国);GM-1800恒温冰冻切片机(山顿公司,英国);MOTICB5双目生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,中国)。1.2实验大鼠造模成功的检测1.2.1大鼠肾虚血亏模型的建立剪去大鼠尾端0.25~0.30cm,放尾血10滴,隔天放血1次［2－3］。严格控制大鼠每天饲料量,通过饥饿(正常大鼠摄入普通饲料量在15~20g/d,而模型则给予9g/d)加速模型形成［4］。同时,灌服羟基脲450mg/(kg·d)［5］,隔天1次,连续2周。首次放血前先称重,并采集血液测定血红蛋白及红细胞数,放血2周后,再次采集血液测定血红蛋白及红细胞数。肾虚血亏模型大鼠会出现体重下降,精神萎靡,不活跃等症状,并有皮毛蓬松脱毛现象。本次实验中,与造模前相较,造模后大鼠体重明显下降(P<0.01),含血红蛋白量及红细胞计数均明显下降(P<0.01)。连续阴道上皮细胞涂片,观察阴道上皮细胞角质化情况,以阴道上皮细胞角质化无明显周期性变化者视为大鼠月经周期紊乱,提示肾虚血亏大鼠造模成功。见表1。1.2.2实验分组与给药将造模大鼠随机分组,A组为模型组共11只,B组为乌鸡白凤丸低剂量组共11只,C组为乌鸡白凤丸中剂量组共11只,D组为乌鸡白凤丸高剂量组共10只,另选取雌性SD大鼠10只为E组(空白对照组)。B组灌服0.20g/kg的乌鸡白凤丸溶液,C组灌服0.40g/kg的乌鸡白凤丸溶液,D组灌服0.80g/kg的乌鸡白凤丸溶液,分别相当于成人临床等效剂量的1、2、4倍;A、E两组灌服同等容积的蒸馏水,连续4周。1.2.3指标检测(1)大鼠子宫组织形态学变化检测取大鼠子宫组织,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规制备组织切片,HE染色,在光学显微镜下观察子宫内膜厚度及腺体情况。(2)大鼠子宫内膜组织ER、PR以及VEGF蛋白的表达实验步骤:①取子宫组织4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制备4μm组织切片。载玻片经防脱片剂处理(APES);②切片常规脱蜡入水;③蒸馏水加H2O2至0.3%,室温30min以灭活内源性酶,蒸馏水洗涤;④滴加5%BSA封闭液,室温20min。甩去多余液体,不洗;⑤分别滴加兔抗鼠ER、PR、VEGF抗体,37℃120min。0.01MPBS洗3min×3次;⑥ER、PR、VEGF的标本滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG抗体。37℃20min。0.01mol/LPBS洗3min×3次;⑦滴加试剂SABC,37℃20min。0.01MPBS洗5min×4次;⑧DAB显色:使用DAB显色试剂盒(批号k125918D)。取1mL蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般5~20min。蒸馏水洗涤;⑨苏木素轻度复染。脱水透明,封片,显微镜观察;⑩用MAIS医学图像分析系统计算。每张切片随机测定5个视野,在400倍视野下测光密度值,取其均值作为该鼠的平均光密度值。1.2.4统计学分析所有计量资料采用SPSS17.0统计软件进行处理,以(ue003±s)表示。组间比较若满足正态性者,使用单因素方差分析,两两比较方差齐者采用LSD法,方差不齐时,用秩和检验,组间比较用Kruska1-Wallisttest。2结果2.1不同剂量hd大鼠精子内皮厚度和组织病理学空白组大鼠子宫壁各层结构清晰,子宫内膜完整,无空泡样改变,子宫腔管径较粗,内膜腺体丰富,腺体由单层柱状上皮构成,无明显增生。模型组子宫内膜变薄,有空泡样改变,腔管径较狭窄,体积变小,内膜腺体管腔扩张,腺上皮变薄,部分见空泡样改变;肌层变薄,可见炎症细胞浸润。乌鸡白凤丸低剂量组大鼠子宫内膜厚度较模型组有所增加,腔管径稍扩大,腺体管腔亦扩张,腺体上皮变薄,腺体上皮核分裂较多,呈增生状态。乌鸡白凤丸中组和高剂量组子宫壁各层结构清晰,子宫内膜比较完整,单层柱状上皮较模型组无明显增生;各层细胞未见变性及坏死;内膜腺体管腔扩张及腺上皮变薄现象较模型组有减轻趋势,见插页Ⅲ图1。2.2种体外er、vegf蛋白表达水平对鸡白凤丸表达的影响采用图像分析发现,与空白组比较,模型组ER、PR、VEGF蛋白表达均降低(P<0.01);与模型组相较,乌鸡白凤丸低剂量组ER蛋白表达增强,差异具有显著统计学意义(P<0.01),中、高剂量组ER、VEGF蛋白表达均增加,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。见表2、插页Ⅲ图2~3。3显著缺乏er、pr、vegf蛋白表达中医学认为月经后期和月经过少均属“月经不调”范畴。既往对大量月经过少患者进行宫腔镜检查发现,患者子宫内膜厚度<0.5cm时,其中医症状表现多为虚证,肾虚型子宫内膜最薄,血虚型次之,血瘀型第三,痰湿型第四［6－。月经不调多因肾虚血亏,冲任不充,血海不能按时满溢而经迟或量少。治疗当以补肾养血,益气调经为主。研究表明,月经来潮后子宫内膜的增生修复需要良好的血管发生,功能失调性子宫出血患者中子宫内膜的血管形成往往发生障碍,造成月经后期或月经过少。正常的月经周期中,子宫内膜雌激素受体含量亦呈周期性变化,雌孕激素通过与子宫内膜细胞中特异的激素受体结合来调节月经周期。子宫内膜新血管形成的过程中,需要多种因子共同调控,其中VEGF则是作用最强、特异性最高的调控因子。相关研究提示ER的表达与VEGF的表达存在正相关,通过提高ER蛋白表达可能使VEGF的蛋白表达增加,从而促进子宫内膜血管形成,子宫内膜增生,月经量增加。本实验采用放血、饥饿加灌服羟基脲制备肾虚血亏大鼠模型,发现模型组子宫内膜变薄,有空泡样改变,腔管径较狭窄,体积变小;内膜腺体管腔扩张,腺上皮变薄,部分见空泡样改变;肌层变薄,可见炎症细胞浸润。表明肾虚血亏型子宫内膜薄,伴有子宫内膜的增生减慢、生长发育不良