阴道毛滴虫im培养及免疫原性研究

阴道毛滴虫im培养及免疫原性研究

阴道内皮细胞是生殖于人体膀胱和生殖管的鞭毛虫。阴道毛虫是性传播病象之一，严重危害妇女及其配偶的健康。据WHO统计,全球每年有1.8亿人感染阴道毛滴虫,美国每年有超过700万人感染,我国每年的感染人数则远远超过此数。阴道毛滴虫感染可造成妇女非典型性盆腔炎,增加异位妊娠及宫颈肿瘤的发病率,男性感染则可引起尿道炎,前列腺炎,甚至不孕症。近年研究显示,男性感染阴道毛滴虫可增加患前列腺癌的风险,孕妇感染阴道毛滴虫可造成胎膜早破,早产和低体重儿。阴道毛滴虫的广泛感染和流行还增加了人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)和支原体感染的风险。阴道毛滴虫病的传染源为该病患者及带虫者,本病不仅可通过性接触传播,还可经坐式马桶,公共浴池,泳池等间接途径传播。本研究拟提取阴道毛滴虫分离株全虫抗原并免疫家兔,观察其免疫原性。材料和方法1材料表面1.1害虫植物1.2多种酶制素胰蛋白胨和麦芽糖购于美国Sigma公司;标准胎牛血清购于天津灏洋生物科技公司;青霉素和链霉素购于华北制药公司;HRP标记羊抗兔IgG购于北京博奥森生物技术有限公司;Cy3标记山羊抗兔IgG购于美国SantaCruz公司。2方法2.1虫体活动能力的观察和传代将阴道毛滴虫临床分离株接种于TYM培养基中,并加入20%热灭活胎牛血清及青、链霉素各1500U/ml,37℃无菌培养,每12h镜下观察虫体活动能力,数量,形态及有无杂菌生长,当虫体密度达到对数生长期,即1×106/ml时进行传代,连续培养数代后即可达到纯培养。选取纯培养、活力强的对数生长期虫株培养液10ml,以1500g离心10min,弃上清,加入PBS缓冲液漂洗沉淀3次,然后加入0.5mlPBS缓冲液混匀,应用BCA蛋白定量试剂盒检测全虫抗原蛋白浓度,-20℃冻存备用。2.2阴道毛滴虫免疫血清的制备、测定和提取2.2.1引起更大的免疫取1ml阴道毛滴虫全虫抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合充分乳化后于家兔脊柱两侧、肩部、臀部、两侧鼠蹊部等部位皮下多点注射免疫,每隔2周用同等剂量的全虫抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合,以同样的方法加强免疫2次。末次免疫后第7d耳缘静脉采血,分离血清,用ELISA检测抗体效价,当抗体滴度高于1∶6400时进行颈动脉采血,分离血清备用。2.2.2elisa试验棋盘滴定法确定阴道毛滴虫全虫抗原的最佳包被浓度为3.65μg/ml,用稀释缓冲液将阴道毛滴虫免疫兔血清倍比稀释(1∶10,1∶102,1∶103,1∶104,1∶105,1∶106,1∶107)后作为为一抗,以1∶5000稀释的HRP-羊抗兔IgG为二抗进行ELISA,加入OPD显色后测定A490值。试验设健康兔血清对照(阴性对照)和空白对照。以待测样品A490值/阴性对照A490值≥2.1判定为阳性。2.2.3阴道内寄生虫和全虫免费输血的纯度制备的免疫兔血清采用饱和硫酸铵沉淀法粗提IgG,-20℃保存备用。2.3对阴道毛滴昆虫全虫抗性分析及免疫原性的评价2.3.1阴道毛滴虫全虫抗体分析全虫抗原经12%SDS电泳,电泳完毕后用考马斯亮蓝R-250染色并脱色,应用BandScan5.0软件分析蛋白组分。2.3.2小鼠阴道毛滴虫免疫兔血清igg的检测阴道毛滴全虫抗原经SDS电泳进行转膜、封闭,以1∶100稀释的阴道毛滴虫免疫兔血清为一抗,以1∶5000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG为二抗进行Westernblot,加入DAB显色后扫描反应结果并保存。试验设阴道毛滴虫免疫小鼠血清对照。2.3.3间接免疫荧光试验以阴道毛滴虫虫体为抗原,以全虫抗原免疫兔血清为一抗,以1∶80稀释的Cy3红色荧光素标记的山羊抗兔IgG为二抗进行间接免疫荧光试验,并用DAPI进行复染,用甘油封片缓冲液封片后置于荧光显微镜下观察结果并拍照记录。试验设健康兔血清对照,鼠免疫血清对照和PBS对照。结果1虫体生长情况观察用含10%热灭活标准胎牛血清的TYM培养基培养阴道毛滴虫,每隔12h镜下观察虫体生长状况,结果见图1。阴道毛滴虫在48h左右达到最高生长密度2.74×106个/ml,36~48h为其对数生长期,连续培养3代后即达到纯培养。2间接elisa试验以阴道毛滴虫全虫抗原包板,以全虫抗原免疫兔血清为一抗,以HRP-羊抗兔IgG为二抗进行间接ELISA。结果显示,阴道毛滴虫全虫抗原免疫兔血清抗体滴度大于1∶1×106(表1)。3染色并脱色全虫抗原经12%SDS电泳后用,考马斯亮蓝R-250染色并脱色,应用BandScan5.0软件进行分析后。结果显示阴道毛滴虫全虫抗原蛋白带分布在10~150ku之间,其中30~70ku之间的蛋白带最为密集(图2)。4变质蛋白凝胶的制备Westernblot显示,阴道毛滴虫全虫抗原蛋白带中能被免疫兔血清识别的共有15条(19、23、24、33、35、48、51、56、65、80、98、105、120、131、150ku),其中23、33、51、65、120ku组分为粘附蛋白,而健康兔血清则不与全虫抗原发生反应。与BALB/c小鼠免疫血清相比,免疫兔血清多识别3条带,分别为24、80和150ku(图3)。5免疫荧光结果以全虫抗原免疫兔血清为一抗,以Cy3红色荧光素标记的山羊抗兔IgG为二抗对阴道毛滴虫进行免疫荧光染色,并用DAPI进行复染,结果见图4。虫体的膜及胞质均呈红色荧光,即虫体能够被全虫抗原免疫兔血清识别,而虫体则不能与健康兔血清发生免疫反应。不同免疫血清在小鼠体内的免疫反应阴道毛滴虫全虫抗原的成分比较复杂,它不仅包含了可溶性抗原成分,还包含了颗粒性抗原成分以及分泌性抗原成分。本实验对阴道毛滴虫全虫抗原进行SDS分析,结果也证实了其成分的复杂性,其分子质量范围在10~150ku之间。面对如此复杂的抗原成分,若要获得效价高的免疫血清,实验动物及免疫方法的选择尤为重要。新西兰兔由于对外源性抗原反应敏感,能产生效价强度较高的抗体,因此常被用于制备多克隆抗体。相对大鼠和小鼠而言,家兔个体更大,且便于固定,耳部血管丰富而易于采血。本实验需要对制备的免疫血清进行纯化,对免疫血清的需求量较大,因此选用家兔更适合实验需要。在免疫接种方法的选择上,本实验选择将抗原与弗氏佐剂等体积混合进行皮下注射的方法。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的免疫佐剂,弗氏不完全佐剂的成分主要为液体石蜡油及羊毛脂,完全佐剂是在不完全佐剂的基础上添加了灭活的结核杆菌,将抗原与弗氏佐剂充分乳化为油包水的抗原复合物形式后接种动物,可增加抗原的免疫反应性。这是由于佐剂中的结核杆菌的抗原成分可以激发机体的免疫系统,使免疫反应增强,而且油包水的形式增大了抗原的表面积,使得抗原更容易被巨噬细胞所吞噬,油包水的形式还延缓了抗原在皮下注射的后的吸收速度,使得免疫反应稳定而持续。本实验将阴道毛滴虫全虫抗原与弗氏佐剂充分乳化后进行3次皮下注射免疫(间隔2周),将制备的免疫血清抗体滴度>1∶1×106。Westernblot检测显示,该免疫血清能识别全虫抗原中的19、23、24、33、35、48、51、56、65、80、98