光谱分析-饲料添加剂维生素C中Vc含量测定

项目1.1饲料添加剂Vc含量检验模块1：光分析任务引入山东天力药业有限公司，生产饲料添加剂维生素C，其主要技术指标要求Vc含量控制在99.0—101.0%之间，以保证产品质量。分析检测人员按照检测标准和规范化操作要求，完成Vc含量测定并提交检测报告。任务分析完成饲料添加剂维生素C中Vc含量的测定，需要具备的基本知识和基本技能任务分析光吸收定律紫外可见分光光度计的操作使用光分析基本原理吸收曲线的绘制任务资讯

制定检测方案

决策计划

实施样品检测任务实施

任务检查评价

检查评价获取相关知识Vc含量测定

吸光光度法的基本原理大千世界，物质颜色是如何产生的？任务资讯光的电磁波性质

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光牛顿光学实验.swf任务资讯——光的基本性质光的波粒二象性波动性粒子性λνσT

E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,焦耳）ν：光子的频率（Hz,赫兹）λ：光子的波长（nm）c：光速（2.9979X1010cm.s-1）h：plank常数（6.6256×10-34J.s）任务资讯——光的基本性质单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。紫400红660橙600黄560绿530青500青蓝450蓝420任务资讯——光的基本性质物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过物质对光的吸收光谱示意表观现象示意复合光吸收黄光任务资讯——物质颜色的产生

溶液的颜色：

是由于它选择性地吸收了一部分光，而呈现它的互补色。

例如：三(邻二氮菲)合铁配合物溶液吸收了508nm处的光，而呈现紫红色。任务资讯——物质颜色的产生物质对光的吸收程度与什么有关？任务资讯1、透光率Transmittance(透射率，透射比)透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It结论：溶液的透光率越大，表示它对光的吸收越小；相反，透光率越小，表示它对光的吸收越大。

任务资讯——几个概念2、吸光度A吸光度定义：实践证明，溶液吸光度，与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关。吸光度与透光率的关系任务资讯——几个概念入射光I0透射光ItA

1

2

3

4…

nA3A1AnA2…A43、物质的吸收光谱

吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为最大吸收波长，

max

任务资讯——几个概念吸收曲线的讨论：①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。任务资讯——几个概念⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。浓度越大，吸光度也越大。此特性可作作为物质定量分析的依据。吸收曲线的讨论：任务资讯——几个概念光的吸收程度与光程长的关系？4、朗伯—比耳定律任务资讯——几个概念朗伯定律比尔定律光的吸收程度与浓度的关系？4、朗伯—比耳定律任务资讯——几个概念A

C增大①当c的单位为g·L-1时，比例常数用a表示，称为质量吸光系数

A＝abρ②当c的单位用mol·L-1时，比例常数用

表示,称为摩尔吸光系数

A＝

bca

的单位:L·g-1·cm-1朗伯-比耳定律数学表达式

A＝kbc

式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；K的取值与浓度的单位有关K比例常数入射光波长物质的性质温度

的单位:L·mol-1·cm-1=a·M任务资讯——几个概念光吸收定律（定量分析的理论基础）成立的条件：一是必须使用单色光二是吸收发生在均匀的介质三是吸收过程中，吸收物质互相不发生作用物理意义：当一束平行单色光垂直通过某均匀透明的吸光介质时，其吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。任务资讯——几个概念例：某有色溶液在2.00cm吸收池中，测得T=50%，若改用1cm的吸收池，其T和A各为多少？解：先求有色溶液在2.00cm吸收池中吸光度A，A=-lgT=-lg50%=0.30由于吸光度与液层厚度成正比，可求得厚度为1cm时吸光度，b=1cm,A=0.30/2.00×1.00=0.15T=10-0.15=71%任务资讯——几个概念紫外可见吸收光谱有何用途？任务资讯紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。一.定性分析1、未知化合物的定性鉴定

每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。在相同的实验条件（仪器条件、溶剂）下，将未知物的紫外光谱与标准物质的紫外光谱进行比较，若两者谱图相同，可认为含有相同的生色团，但不一定是相同的物质。任务资讯——紫外可见吸收光谱的应用2.纯度的鉴定

用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如苯256nm处有B带，而甲醇、乙醇无吸收带，可鉴定其纯度。3.结构分析

紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。任务资讯——紫外可见吸收光谱的应用二、定量分析1.单组分的定量分析（1）吸光系数法（绝对法）【例1-4】P17（2）标准对照法As=kbCsAx=kbCxCx=AxCs/As

任务资讯——紫外可见吸收光谱的应用(3)标准曲线法

配制一系列浓度不同的标准溶液，分别测定其吸光度，用吸光度对浓度作图。再测定未知液的吸光度Ax，从工作曲线上查得其浓度。cAAxcx？？？任务资讯——紫外可见吸收光谱的应用紫外-可见分光光度计主要部件有哪些？任务资讯光源单色器吸收池检测器信号显示系统组成结构任务资讯光源：提供符合要求的入射光。要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。紫外光源---氘灯(185-375nm)可见光源---钨灯(320-1000nm)光源任务资讯单色器棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400任务资讯原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图任务资讯光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。吸收池：又叫比色皿，用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。主要有石英吸收池和玻璃吸收池两种。在紫外区须采用石英吸收池，可见区一般用吸收玻璃池。吸收池主要规格0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm注意事项：手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三。任务资讯检测器：利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。常用的检测器有光电池、光电管及光电倍增管。

光电池

光电管光电倍增管任务资讯以检流计或微安表指示仪表数字显示和自动记录型装置

信号显示系统任务资讯作用：将复合光色散成单色光紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯，氘灯，185~350nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定棱镜玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm光栅平面透射光栅，反射光栅比色皿：玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示任务资讯0.575I0参比样品入射光I0透射光It请注意与定义比较未考虑吸收池和溶剂对光的作用任务资讯

为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，消除光在溶液中的散射和比色皿对光的反射等的因素的影响，必须采用参比溶液作对照。测定时，首先将参比溶液置于光路，调节仪器的“Zero”键，使A=0或T=100%，然后开始测定标准溶液或被测液的A。参比溶液作用：调零（A=0或T=100%

）任务资讯按波长范围划分：可见分光光度计（400-780nm）紫外可见分光光度计(200-1000nm)紫外可见分光光度计类型按光路划分：单光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计任务资讯单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示任务资讯单光束分光光度计双波长分光光度计双光束分光光度计光路任务资讯如何使用紫外-可见分光光度计？任务资讯用白纸片遮住光路，改变波长从750nm到400nm，观察白纸片中颜色的变化。波长准确度的准确检查(动画)谱钕滤光片吸收曲线苯蒸汽的吸收曲线仪器的校验一任务资讯

波长

/nm

温度

/℃2352573133502518.213.751.322.9

以0.001mol.L-1HClO4为参比，以1cm的石英比色皿做吸收池，分别在235、257、313、350波长处测定相应溶液的透射比。仪器的校验二透射比正确度的检验任务资讯JJG178-96规定：石英吸收池：220nm、蒸馏水；350nm、K2Cr2O70.001mol.L-1HClO4溶液；玻璃吸收池：600nm、蒸馏水；相对校正法：用一套比色皿装待测试样的溶剂，以其中一个为参比，测定其他吸收池的吸光度(或T)。若吸光度为零，或相等，（或ΔT<0.5%）即可配对。若不相等，可选最小吸光度值的作参比，测定其它的吸光度，求修正值。仪器的校验三吸收池成套性检验任务资讯常见的几种型号仪器使用方法721型可见分光光度计722型可见分光光度计UV-2000分光光度计UV756MC型紫外可见分光光度计任务资讯查阅资料◆GB/T7303-2006饲料添加剂维生素C（L—抗坏血酸）◆资料一：利用紫外吸收光谱检查物质的纯度◆GB/T603化学试剂◆GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法决策计划决策计划——确定Vc含量的测定方法

信息样品性质及相关分析方法确定方法提要氯离子含量的表示方法主要成分:Vc,含量约99.0%—101.0%用紫外分光光度法称取一定量的标准样品和待测样品处理后，用紫外分光光度计绘制吸收曲线确定λmax，然后分别测定两者吸光度A用质量分数表示A=kbc质检员准备检测用仪器仪器清单（参考）分类名称规格数量名称规格数量小组公用仪器UV-18011台烧杯2000mL1只石英比色皿2只量筒10mL1个个人用（人均一份）分析天平1台试剂瓶1000mL1只容量瓶100mL4个烧杯100mL2只吸量管10mL1支洗瓶1个任务实施质检员准备检测用试剂试剂清单（参考）名称盐酸Vc标准品饲料添加剂Vc规格ARAR样品任务实施质检员准备检测用溶液溶液准备单（参考）溶液名称浓度用量配制方法盐酸0.01mol/L2000mL用量筒量1.8mL的浓盐酸，加入盛有一定体积的蒸馏水的烧杯中，并稀释至2000mL，贮存于玻璃细口瓶中Vc标样储备液0.8mg/mL

100mL称取0.0800gVc标样，用0.01mol/LHCl溶解并定容于100mL容量瓶中。

Vc试样储备液0.8mg/mL

100mL称取0.0800g饲料添加剂Vc，用0.01mol/LHCl溶解并定容于100mL容量瓶中。

任务实施配制浓度约为0.01mol·L-1HCl标准溶液用量筒量取浓盐酸1.8ml倒入盛有定量、适量水的烧杯中，冲稀至2000mL储存于1000mL试剂瓶中任务实施标样、试样的配制任务实施分别准确称取Vc标准品、饲料添加剂Vc0.0800g在小烧杯中用蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容测定Vc含量任务实施测定条件：1.波长范围：200—350nm2.参比：0.01mol/LHCl测定步骤1.根据实验条件对UV—1810进行调节。2.分别取Vc标样储备液和Vc试样储备液1mL于2只100mL容量瓶中，用0.01mol/LHCl稀释至刻度。3.以0.01mol/LHCl空白试剂为参比，在200—350nm区域，测绘Vc标样的紫外吸收光谱，并在图中确定其最大吸收波长。4.在3中选择的最大吸收波长处，以0.01mol/LHCl空白试剂为参比，分别测定Vc标样和Vc试样的吸光度。■仪器规范使用方面■数据记录、计算方面■结果准确度、精密度方面■误差原因分析检查与评价偏离朗伯—比耳定律的原因

用标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现当溶液浓度较高时标准曲线常发生弯曲，这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。任务引领下的知识拓展与深化

①物理性因素

吸收定律成立的前提条件之一是入射光为单色光，但实际上难以获得真正的纯单色光。在实际工作中，为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，而复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。任务引领下的知识拓展与深化

②化学性因素溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。当溶液浓度c>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：2CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。任务引领下的知识拓展与深化

哪些物质可用紫外-可见分光光度法进行分析？任务引领下的知识拓展与深化

化合物的紫外—可见吸收光谱一、有机化合物的紫外—可见吸收光谱1、有机化合物的电子跃迁有机化合物的紫外吸收光谱，取决于分子中外层电子的性质。有机化合物分子中通常有三类电子，σ电子、π电子、n电子任务引领下的知识拓展与深化

即形成单键的σ电子、形成不饱和键的π电子以及未参与成键的n电子（孤对电子）。处于基态的分子在吸收一定波长的光后，分子中的成键电子和非键电子可被激发跃迁至σ*和π*反键轨道

有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果：任务引领下的知识拓展与深化

分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。任务引领下的知识拓展与深化

其跃迁类型有σ→σ*、n→σ*、π→π*和n→π*四种，其相对能量大小次序为：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*有机物最有用的吸收光谱是基于n→π*和π→π*跃迁而产生的。任务引领下的知识拓展与深化

⑴σ→σ＊跃迁所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ<200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)。如甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为135nm。⑵n→σ＊跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*跃迁的λmax分别为173nm、183nm和227nm。任务引领下的知识拓展与深化

⑶π→π＊跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如乙烯π→π*跃迁的λmax为162nm，εmax为:1×104L·mol-1·cm－1。⑷n→π＊跃迁需能量最低，吸收波长λ>200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸光系数一般为10～100L·mol－1·cm－1，吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π＊跃迁。丙酮n→π＊跃迁的λmax为275nmεmax为22L·mol－1·cm－1（溶剂环己烷)。任务引领下的知识拓展与深化

（1）生色团（chromophore)：把含π键的结构单元称为生色团。

在紫外和可见光区产生吸收带的基团称为生色团。因为只有由π→π＊和n→π＊跃迁才能产生紫外可见吸收，而这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团，所以这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基-N＝N-、乙炔基、腈基-C≡N等。2、常用术语任务引领下的知识拓展与深化

（2）助色团（auxochrome)：

有一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH２、-NHR、-X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n-π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。任务引领下的知识拓展与深化

化合物取代基Λmax/nmεmax苯254300氯苯-Cl264320溴苯-Br262325苯酚-OH2731780苯甲醚-OCH32722240任务引领下的知识拓展与深化

（2）、红移和蓝移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）任务引领下的知识拓展与深化

3.影响紫外-可见吸收光谱的因素

物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（共轭效应、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。（1）共轭效应当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置可以分为共轭和非共轭两种情况：非共轭时，各个生色团各自独立吸收，吸收带由各生色团的吸收带叠加而成；任务引领下的知识拓展与深化

共轭后，π电子运动范围大，π*轨道能量降低，π→π*跃迁能级差减小，吸收光谱红移，ε（摩尔吸光系数）值增大。共轭不饱和键数目越多，红移越显著。下表列出了一些有关共轭结构的化合物。化合物共轭双键数11955000220010000221721000325425000325835000任务引领下的知识拓展与深化

（2）溶剂效应溶剂不同，同一种物质得到的光谱可能不一样，这种现象称为溶剂效应。随着极性增加，π→π*跃迁的吸收波长变大，n→π*跃迁的吸收波长变小。见P10表1-7任务引领下的知识拓展与深化

任务引领下的知识拓展与深化

(3)溶液的PHE2BPh-OHPh-O-210(6200)235(9400)270(1450)287(2600)Ph-NH2Ph-NH3+230(8600)203(7500)280(1430)254(169)任务引领下的知识拓展与深化

4、常见有机化合物的紫外-可见吸收光谱（1）饱和烃及其取代衍生物烷烃：C-C，C-H只产生σ→σ*跃迁，λmax＜150nm，在近紫外区无吸收。因而饱和烷烃可用作紫外吸收测定的溶剂。如CH4λmax=125nm；CH3CH3λmax=135nm饱和烃上H被杂原子取代σ→σ*红移，并产生n→σ*跃迁。n→σ*仍在远紫外区；某些n→σ*可以在近紫外区产生吸收。CH4:σ→σ*125nm，CH3I:n→σ*259

nm任务引领下的知识拓展与深化

部分含杂原子的饱和化合物n→σ*吸收化合物λmaxεmax溶剂甲醇177200己烷1-己硫醇224126环己烷三甲基胺199395己烷氯代甲烷173200己烷溴代甲烷208300己烷任务引领下的知识拓展与深化

（2）不饱和烃及共轭烯烃σ、π：σ→σ*跃迁、π→π*跃迁单个双键，共轭双键：π→π*跃迁，吸收峰在远紫外区，乙烯175nm，1,5-己二烯185nm烯碳上取代基数目增加，λmax红移。任务引领下的知识拓展与深化

共轭双键：π→π*跃迁红移，增色，共轭双键中π→π*跃迁所产生的吸收带称为K带，其特点是强度大（ε＞104），λmax≥217nm，K带的λmax、εmax与共轭体系的数目、位置、取代基的种类有关。双键与带n电子的杂原子相连：由于n→π共轭，π→π*跃迁能量减小，波长红移。任务引领下的知识拓展与深化

（3）芳香族化合物

苯：具有环状共轭体系，由π→π*产生三个吸收带：

E1184nm4.7×104E2203nm7.9×103B255-230nmB带是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引起，也称为精细结构吸收带。B带是芳香族化合物的重要特征吸收带。任务引领下的知识拓展与深化

（4）羰基化合物n→π*、n→σ*、π→π*