分子生物学综合大实验实验报告

分子生物学综合大实验实验报告分子生物学综合大实验实验报告外源基因SOC1的扩增和重组载体的构建与筛选班级姓名学号实验目的通过PCR技术克隆外援基因SOC1的目的片段。通过质粒提取，酶切和连接技术，把SOC1基因重组进TA克隆载体并完成筛选。实验用品材料：植物叶片，TA克隆载体试剂：DNA提取液（1L）TE缓冲液；琼脂糖；核酸染料；；DNAmarker；6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油）、DNA聚合酶、dNTP、上下游引物器材：研钵，恒温水浴，离心机，离心管，PCR仪、生化培养箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，去离子水、超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，酒精灯等。实验原理通过配制DNA提取液，利用研磨法获得DNA模板，然后采用PCR技术扩增基SOC1基因获得目的片段，然后通过酶切和连接方法把SOC1基因连接到TA载体上。大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。并通过氨苄抗性筛选获得重组子实验方法步骤1、植物基因组DNA的小量提取（1）剪取新鲜幼嫩的植物叶片1~2片于1.5mL离心管中.（2）先加入少量的DNA提取液100μL，用研磨棒充分研磨尽量避免提取液溅出。（3）再加入600μL的DNA提取液，使DNA提取液的总体积为700μL，上下颠倒混合均匀。（4）放入高速离心机4℃条件下12000rpm离心15min。（5）取上层水相，移入标有相应序号的新的离心管中，加入600μL的异丙醇（与加入DNA提取液的总体积相同），上下颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中40min或以上，使DNA沉淀。（6）放入高速离心机，4℃条件下12000rpm离心10min，沉淀DNA，弃上清。（7）加入1mL70%的乙醇洗涤，放入高速离心机，4℃条件下12000rpm离心5min。（8）重复步骤（7），洗去DNA中的杂质。（9）将离心管倒置在吸水纸上，待干燥后，加入20μL60℃双蒸水，DNA完全溶解后，放4℃冰箱待用，长期保存需放入-20℃。2、PCR扩增SOC1目的片段（1）准备PCR反应溶液10μl体系：ddH2O：4.9μlTaq聚合酶：0.1μl上游引物：1μl下游引物：1μldNTP1μl模板：1μl扩增缓冲液1μl总体积：10μl（2）PCR扩增反应（循环数25）PCR程序：1,94℃2min2c，94℃30s3c,55℃30s4c,72℃1min5,72℃10min6,16℃30min3、琼脂糖凝胶电泳（1）称取1g琼脂糖加入250mL锥形瓶中，量取100ml1×TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。（2）微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。（3）待胶冷却至60℃左右加入7μL的核酸染料，轻摇混匀。（4）向胶板中倒胶，插上梳子，静置约30min待凝胶完全冷却。（5）拔出梳子，将凝胶连同支撑用的模具一起转移到加入了1×TAE电泳缓冲夜的电泳槽中，使电泳缓冲液淹没凝胶，上样。150V，200mA电泳约20min。（6）取出凝胶，扫胶记录电泳结果。4、TA质粒DNA的提取和纯化（1）取培养过夜的菌液于离心管中，12000rpm离心2min，将上清弃去。重复操作增加集菌量。（2）加入250μL含RNaseA的SolutionI充分悬浮细菌沉淀。（3）加入250μLSolutionII缓慢轻轻上下颠倒5~6次，直至溶液透明。（4）加入350μL4℃预冷过的SolutionIII，缓慢轻轻上下颠倒5~6次，直至凝集块紧实，然后室温静置2min。（5）常温条件下，高速离心机12000rpm离心10min。取上清。（6）将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上，并平衡柱子。（7）步骤（5）中的上清转移至SpinColumn，室温下，高速离心机调至12000rpm离心1min。弃滤液。（8）将500μLBuferWA加入SpinColumn，室温下，高速离心机调至12000rpm离心30s。弃滤液。（9）将700μLBuferWB加入SpinColumn，室温下，高速离心机调至12000rpm离心30s。弃滤液。重复一次。5、质粒DNA的限制性酶切小量酶切反应体系本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20μl体积中含0.2—1μgDNA，酶切反应体系如下：质粒DNA5μl10×缓冲液1μl限制酶（根据质粒酶切位点选择）1μl双蒸去离子水3μl总体积10μl（1）在一灭菌的新的Ep管中加入3μl双蒸水。（2）加入10×缓冲液1μl。（3）加限制酶1μl。（4）最后加入质粒DNA5μl。（5）稍离心，混合。（6）37℃水浴1—1.5h。（7）取出后电泳分析鉴定是否酶解。6、重组载体的连接(1)将的目的片段与对应的空质粒同时进行双酶切，条件一般为37℃，2-3小时。(2)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别进行回收，测定浓度，依此来计算二者之间的分子个数的比值。进行酶连时，向300ulEppendorf管中依次加入以下体系：酶切载体3μL目的基因片段1μLSolutionI连接酶4μL（3）16℃水浴锅中连接，3个小时以上。7、大肠杆菌感受态细胞的制备（1）接种大肠杆菌单菌落于2mLLB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。（2）将2mL过夜培养物转接到盛有100mL的LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2h）。（3）取1mL培养物于一灭菌的1.5ml管中，冰浴放置10min，4℃，1500×g离心5min，弃上清。（4）沉淀用0.2mL冰冷100mmol氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清。（5）沉淀再用0.2mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。8、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞（1）取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min待其完全溶解。（2）在净化工作台内，将质粒DNA1ul加入感受态细菌100ul的离心管内，混匀，置冰上30分钟。从超净台中取出，置于冰上静止30min。（3）42℃热激90s，时间一定要准确，迅速转入冰上静止2min以上。（4）在超净工作台，加入0.9mL不含任何抗生素的LB液体培养基，在摇床中37℃，180rpm培养1h。（5）取出37℃预热了30分钟的LB琼脂固体培养基（含氨苄青霉素100ug/ml）平皿，点上酒精灯，将消毒浸泡的涂布棒凉干。（6）在37℃恒温培养箱内将培养基倒置，过夜培养。主要参考文献1．《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，美）奥斯伯，２００82．《分子生物学实验技术》，北京大学出版社，郝福英，1998年3．《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，萨母布鲁克著，黄培堂等译，20054.《分子生物学实验指导》，高等教育出版社，魏群.2007.11实验结果1、DNA提取的电泳图（根据跑的电泳结果画