人型前胶原含量测定的ria法及其在肝硬化诊断中的应用

人型前胶原含量测定的ria法及其在肝硬化诊断中的应用

1992年，作者从流行性出生的皮肤中提取并提取了i类原羟基（hpc），建立了血清hpc的ria法，并在临床上推广。但由于技术条件限制,受提取抗原活性及抗体效价、亲和力的影响,操作繁琐,时间长,不利于临床使用。1996年作者改善了抗原的提取和抗血清的制备工艺,改进了hPCⅢRIA,现报道如下:材料和方法1高盐废水浓缩取4-6个月人流胎皮,制成匀浆。在4℃用内含蛋白酶抑制剂的Tris-HClpH7.4缓冲液,提取48h。离心,上清液加硫酸氨盐析。低温高速离心,沉淀溶解后盐析,超速离心。沉淀溶解透析除盐、浓缩。采用中压层析系统,上DEAE-32纤维素柱层析除去酸性糖蛋白,再经DEAE-52纤维素柱梯度洗脱,收集第二峰,并在1‰醋酸溶液中透析除盐,浓缩即得hPCⅢ,于-85℃备用。2蛋白质标准品将hPCⅠ、hPCⅢ,牛PCⅢ、Ⅲ型胶原标准品,由Sigma公司提供;高分子量蛋白质标准品,由Pharmacia公司提供。经β巯基乙醇还原、用5%凝胶作SDS垂直平板电泳。3hpca免疫取300μghPCⅢ与等量完全福氏佐剂乳化后,于皮内背部两侧多点注射免疫家兔。每隔两周用200μghPCⅢ追加免疫,两个月后耳静脉取血,测抗血清效价。最后颈动脉放血,分离血清-85℃冷冻保存。412hpcndb的降解用改进氯胺T法将hPCⅢ标记125I。在尖底塑料管加入50μLpH7.5PBS和10μghPCⅢ、1.85×107BqNa125I,混匀后,加20μg氯胺T,反应1.5min,加30μg半胱氨酸终止反应。经G-25柱,收集蛋白峰。测标记率及放化纯度。5混合分离剂用工作缓冲液将hPCⅢ标准品配成0、40、80、160、320和640μg/L系列浓度。分离剂为二抗+6%PEG。抗血清工作液用0.1%BSA-2%NRS-0.05mol/LPBSpH7.4溶液配成1:50000。6前例不同性别组不同年龄性别肝功能分级情况肝炎与肝硬化按1995年全国传染病寄生虫会议修订的诊断标准,原发性肝癌按中国常见恶性肿瘤诊治规范中的标准。共测定384例血清hPCⅢ。急性肝炎组:33例,男20例,女13例,年龄15-60岁,均系黄疸型;慢活肝组:23例,男18例,女5例,年龄23-57岁;慢迁肝组:28例,男15例,女13例,年龄16-55岁;单纯型肝癌组:42例,男34例,女8例,年龄15-67岁,其中29例有手术或病理诊断;肝硬化组:50例,男35例,女15例,年龄25-73岁,其中15例有手术或病理诊断;肝癌合并肝硬化组:63例,男48例,女15例,年龄21-78岁,其中46例有手术或病理诊断;胆石症组:20例,男14例,女6例,年龄17-53岁,全部手术并取肝活检;其它肝病组:25例,男15例,女10例,年龄15-72岁,包括肝血管瘤,脂肪肝等。正常参考组:100名,男55名,女45名,年龄18-47岁,为健康献血员。7hpc-hpc法取100μL标准品(或待测样品),200μL抗血清,100μL125I-hPCⅢ混匀后,4-8℃,放置4h。加入200μL分离剂,室温放置30min,3500r/min离心20min,测沉淀计数率。结果1染色及分子量提纯的hPCⅢ经SDS电泳后,可见单一条区带,经β巯基乙醇还原后可见两条区带Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)。染色为胶原特有的粉红色特征,与文献报道一致。与原方法相比,电泳图谱更清晰,说明抗原纯度更高。hPCⅢ由3条Proα1(Ⅲ)组成,经测定Proα1(Ⅲ)分子量为190kD,高于文献报道动物Proα1(Ⅲ)的14.5-180kD。hPCⅢ约为570kD。2工作滴度3只兔免疫成功,经琼脂双扩散法测定抗血清效价为1:128以上,经RIA测定最终工作滴度分别为1:50000;1:45000和1:30000倍。与hPCⅠ的交叉反应率为0.81%、与胶原CⅣ、CⅢ、CⅠ无交叉反应,见图,过量抗体结合率大于80%。3125i-hpc标记结果125I-hPCⅢ的标记率为70%-80%,放化纯度为98.5%±3.8%(n=10),比活度2.65×106Bq/μg。412标准曲线及血清hpc①标准抑制曲线见图,竞争抑制关系良好,测定范围为40-640μg/L。②灵敏度为6μg/L。③精确度:批内CV为4.2%;批间CV为8.2%。④回收率为97.5%-106.3%,平均回收率为99.9%。⑤质量控制:B0/T(%)为59.4%±4.0%(n=10),NSB为3.4%±0.7%(n=10),ED25为495.3±35.9μg/L(n=5);ED50为167.3±12.2μg/L(n=5);ED75为56.7±6.9μg/L(n=5);γ=0.999(n=5)。⑥健全性:将标本作5、10、20、40、90倍稀释,稀释倍数和测定结果呈线性关系。⑦血清hPCⅢ正常参考值为87.5±16.2μg/L,正常上限值为120μg/L(x¯±2s)120μg/L(x¯±2s)。⑧原法和改进法测定结果比较表明:两种方法测同批质控血清hPCⅢ水平无显著性差异(P>0.05)。临床标本的测定结果趋势一致见表1。原方法与混合剂的联合应用人或动物的骨、皮肤中都富含胶原,其中以Ⅰ、Ⅲ胶原为主。提取的方法也各不相同,有从鼠皮和鼠骨中提取PCⅢ,也有从胎羊皮中提取PCⅢ的。因提取方法所采用工艺的不同,得到的PCⅢ纯度和活性不一样,从而影响制备的抗血清效价和亲和力,建立的放免法也各不相同。1992年作者建立hPCⅢRIA非平衡法,由于提取方法简陋,提取流程过长不易控制,致使抗原活性降低,影响抗血清的效价和亲和力,延长了抗原和抗体反应的时间,导致了建立的RIA方法烦琐,稳定性较差。本文采用了先进的抗原提取工艺和抗血清制备方法,抗原提纯时用先进的中压层析系统,采用数字编程控制,缩短了纯化周期和提高了每批层析结果的重现性。电泳结果显示,与原方法相比,图谱更清晰,抗原纯度更高。在免疫动物时将酸溶性的hPCⅢ用醋酸钠中和,提高了免疫动物的成活率和抗血清的效价及亲和力。RIA测试结果表明,抗原纯度与活性显著提高,标记抗原的稳定性和结合率得到较大改善,使抗原抗体的最大结合率由原来的25%提高到60%。免疫动物所得抗血清的效价也由1:3000提高到了1:50000。在此基础上,将原来的非平衡法改进为平衡法,测试时间由原来的56h变为5h,大大缩短了测试时间和测试质量