聚山梨酯80的花色与脂肪酸组成分析

聚山梨酯80的花色与脂肪酸组成分析

这种优质80作为一种难溶性药物，与非肠道制剂的助溶剂、乳化剂和添加剂一起被记录在许多国家的药物中。但随着近年来研究的不断深入,发现其临床注射使用会产生急性超敏反应、外周神经毒性、抑制P-糖蛋白活性以及肝毒性等不良反应。为满足聚山梨酯80注射用的临床要求,需进一步提高其质量,而就质量标准而言,《欧洲药典》和《英国药典》对其控制较为严格,其主要表现在对其脂肪酸组成的控制更加明确。故本文参照《欧洲药典》初步建立聚山梨酯80脂肪酸组成的检测方法并对市售样品进行测定,围绕浊点萃取法、三相分离法以及基于其制备原料(油酸)纯度控制这3种方法对聚山梨酯80进行精制工艺研究,为得到品质更佳的聚山梨酯80产品提供参考。1酯化酸甲酯试剂仪器:Agilent6890N气相色谱仪,DB-WAX毛细管柱(30m×0.32mm,0.5μm);FID检测器。试药:油酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、花生酸甲酯、二十碳烯酸甲酯、山俞酸甲酯,含量均为99%(Sigma公司);聚山梨酯80(市售,批号:080516、080906、090503、080510、090426、090528);油酸(市售,批号:080506、090422、090521);三氟化硼-14%甲醇溶液(Sigma公司);正庚烷(Tedia公司,HPLC级,含量99%);其他试剂均为分析纯;水为市售注射用水。2实验方法2.180年聚山梨酸的测定2.1.1以酰氯酸甲酯为原料的对照品对照品溶液a制备:分别精密称取油酸甲酯(100mg)、肉豆蔻酸甲酯(25mg)、棕榈酸甲酯(50mg)、硬脂酸甲酯(75mg)、花生酸甲酯(100mg)、二十碳烯酸甲酯(50mg)、山俞酸甲酯的对照品(50mg),用正庚烷稀释至50.0mL,即得。对照品溶液b制备:取对照品溶液a溶液1.0mL,用正庚烷稀释至10.0mL,即得。2.1.2氟化硼甲醇溶液的制备取聚山梨酯80约0.10g,置25mL圆底烧瓶中,依次加入2%(w/v)氢氧化钠甲醇溶液2mL回流30min、14%(w/v)三氟化硼甲醇溶液2mL回流30min、正庚烷4mL回流5min,放置回流液至室温,加饱和氯化钠溶液10.0mL,振摇15s,移取正庚烷层2mL,水洗3次(每次2mL),加无水硫酸钠脱水,即得。2.1.3初始温度条件聚乙二醇(PEG-20000)石英毛细管柱(30m×0.32mm,0.5μm),载气为氮气,恒定流速50cm·s-1,分流比10∶1,柱温初始温度为80℃,以10℃·min-1的升温速率升高到220℃并保持40min。气化室温度为250℃,检测器温度为250℃。在此色谱条件下,取对照品a溶液1μL进样,记录色谱图(见图1),硬脂酸甲酯的理论塔板数大于30000,硬脂酸甲酯和油酸甲酯分离度良好(大于1.8);取对照品b溶液1μL进样,肉豆蔻酸甲酯的信噪比大于5,符合《欧洲药典》要求。2.1.4标准工作曲线取对照品a溶液1μL进样,记录色谱图,以各脂肪酸甲酯的相对保留时间tR(去掉溶剂峰的保留时间)对数(1)与其相应的脂肪酸等价碳链长度(X)作图,得工作标准曲线:Y=0.038X+0.454(r=0.9959)。2.1.5等效碳链长度的计算按“2.1.2”项下制备供试品溶液,取1μL进样,记录色谱图(见图2),将《欧洲药典》中要求限量脂肪酸的等价碳链长度代入“2.1.4”项下所得标准曲线,计算求得供试品溶液中各限量脂肪酸保留时间,然后按照面积归一化法求得各脂肪酸组成的百分含量。2.280年处理2.2.1电解质和萃取分离利用聚乙二醇类非离子表面活性剂的“浊点”特性进行聚山梨酯80精制工艺研究。考虑到聚山梨酯80的浊点较高(约85℃),故首先于水相体系中加入适量电解质使其浊点降低,再采用乙酸乙酯萃取分离,萃取液置旋转蒸发器中,于一定条件下回收并除尽溶剂后即得。所得精制样品按“2.1”项下进行脂肪酸组成测定,结果见表2。2.2.1.聚山梨酯80氯化钠水溶液体系配制10%(w/v)聚山梨酯80水溶液置试管中,分别定量加入氯化钠搅拌至溶后,置水浴中程序性升温,观察聚山梨酯80氯化钠水溶液浊点(CP)及稳定沉降层形成温度(Ta),结果见图3所示,浓度为10%的聚山梨酯80水溶液体系随氯化钠浓度的增加,CP与Ta呈下降趋势。当体系氯化钠浓度为15%时,该体系条件下,CP约为40℃,而Ta约为45℃。2.2.1.乙酸乙酯稳定性测定照“2.2.1.1”配制聚山梨酯80样品3份,置45℃水浴中保温,待其形成稳定沉降层后分别按1∶0.5、1∶1和1∶1.5的比例加入乙酸乙酯,充分振摇,静置后观察聚山梨酯80稳定沉降层的变化。试验结果表明,当两者等体积混合时,所形成的乳化界面清晰且乳化区薄,易于萃取。2.2.2脂肪酸组成测定利用特定温度条件下,有机相表面活性剂/水相存在三相平衡体系,进行聚山梨酯80精制。此时,聚山梨酯80的脂溶性杂质主要富集于有机相中,水溶性杂质主要富集于水相中,而相对纯度较高的聚山梨酯80则主要富集于乳化相中。移取乳化层至旋转蒸发器中,80℃下旋蒸至无液体流出,即得。所得精制样品按“2.1”项下进行脂肪酸组成测定,结果见表2所示。油/水介质的选择:在预实验基础上,选用50%正己烷与不同有机溶剂(正丙醇、丙酮、乙酸乙酯等)作为混合油相,分别与聚山梨酯80水溶液混合并充分振摇,静置后观察三相区形成速度及稳定性,结果显示:50%正己烷-10%乙酸乙酯-40%水体系在50℃条件下,保温30min,体系可以形成稳定的三相区。以此油/水介质作为稀释液,分别制成3%、6%、10%(w/w)的聚山梨酯80溶液,将该溶液置50℃水浴中保温30min达三相平衡,考察聚山梨酯80加入量对三相区形成的影响。结果显示:6%的聚山梨酯80溶液所形成的三相界面清晰,易于分离。2.2.3脂肪酸的构成及其检测聚山梨酯80的生产工艺见图4所示,其过程主要分为4步:油酸精馏、酯化反应、聚合反应及脱色精制。由此可推测,聚山梨酯80的脂肪酸组成主要由其原料(油酸)的脂肪酸组成控制,故选用不同纯度的油酸(批号:080506、090422、090521)作为制备原料,按经典高温、碱催化合成法制备3批聚山梨酯80(批号:080510、090426、090528),以《欧洲药典》的检测方法对其脂肪酸组成进行测定,考察精制后聚山梨酯80的内在质量。3结果3.1样品的感官评定结果见表1,由以下结果可知,按“2.2”项下浊点萃取法及“2.3项”以下三相分离法所得精制后样品色泽均得以显著改善,尤其以三相分离法为佳,所得样品溶液颜色为黄色3号标准液,近乎无色,但工艺可操作性较差,聚山梨酯80得率较低。3.23脂肪酸的组成实验结果见表2。3批市售聚山梨酯80,其脂肪酸组成存在较大差异,尤其是棕榈油酸以及油酸的含量波动最为明显。根据《欧洲药典》的规定,两者的脂肪酸组成限量分别为小于8%和大于58%,故在进行脂肪酸组成测定的3批聚山梨酯80中,只有090503批符合《欧洲药典》的脂肪酸组成规定;3批聚山梨酯80经浊点萃取法、三相分离法、(油酸)纯度控制法精制前、后的脂肪酸组成见表2及表3。从表2的结果可知:经浊点萃取、三相分离两种精制方法,聚山梨酯80精制前、后样品的脂肪酸组成无明显变化。但从表3的结果可知:采用聚山梨酯80制备原料(油酸)纯度控制的精制工艺,可以使聚山梨酯80的脂肪酸组成随油酸纯度的提高而得到明显改善,从而达到《欧洲药典》的要求,在一定程度上也说明了油酸的脂肪酸组成直接决定了聚山梨酯80的脂肪酸组成;比较聚山梨酯80与对应的油酸的脂肪酸组成可见,除亚油酸的含量外,其他脂肪酸组成两者间基本未见变化。4聚山梨酯80的精制近几十年来,虽然表面活性剂的精制方法较多,如萃取-重结晶法、浊点析相法、Krafft点结晶法、泡沫分离法、渗析和电渗析、固体吸附剂法、色谱法及新仪器法(程序化自动操作精制装置、三相萃取分离技术、WinsorIII体系优化法)等,但适合于大生产的精制方法主要以萃取-重结晶法和浊点萃取法为代表。本文一方面在预实验的基础上,将经典的浊点萃取法演化为重结晶、浊点、萃取联合精制方法;另一方面引用新仪器法的代表——三相分离法共同对聚山梨酯80进行精制。比较精制前后的结果可知,聚山梨酯80的色泽于两种精制方法精制前后均得以显著改善,尤其以三相分离法精制效果较为理想。聚山梨酯80经浊点萃取、三相分离两种方法精制后,虽其脂肪酸组成未见明显改善,但从另一方面表明了聚山梨酯80色泽的深浅与其脂肪酸组成并无紧密联系。此外,本文进行了基于制备原料(油酸)纯度控制的聚山梨酯80精制工艺研究,结果发现:聚山梨酯80脂肪酸组成在一定程