蛋白质和氨基酸的测定

1概述常量凯氏定氮法半微量凯氏定氮法蛋白质及氨基酸的测定氨基酸定量测定蛋白质的快速测定法一般认为成人每人每天营养需要量为：75克蛋白质。

1.蛋白质的元素组成（Theelementsofprotein）

C：50-55%N：15-18%O：20-23%H：6-8%S：0-4%

微量元素：P、Fe、Zn、Cu但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志一概述22、基本结构单位：氨基酸3

亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。

43、食品中的蛋白质含量一般说来动物性食品的蛋白质含量>植物性食品

5牛肉猪肉兔肉鸡肉

209.52120大豆米面粉菠菜苹果

408.5102.4

0.44.测定蛋白质的方法6二、常量凯氏定氮法1.原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准盐酸溶液滴定，根据标准酸消耗量求出含氮量,乘以蛋白质转换系数即为食物中粗蛋白质含量。78整个过程分四步：消化、蒸馏、吸收、滴定8①

消化

将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O99硫酸钾(或Na2SO4):作为增温剂，提高溶液沸点，加快有机物分解。硫酸铜（氧化汞、汞、硒）：作为催化剂、消化终点指示剂、碱性反应指示剂浓硫酸：

a:利用脱水性，使有机物脱水后被碳化为C、H、N；b:利用强氧化性，使碳化后的C变为CO2，使浓硫酸变为SO2。101313②蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓NaOH，使呈碱性，水蒸气加热蒸馏，释放出氨气。

2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3↑+Na2SO4+2H2O

14

用硼酸吸收形成硼酸铵。2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O14③吸收16

以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。16④滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3计算X=X为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度m为样品的质量F为氮换算为蛋白质的系数0.014---1.00mL硫酸或盐酸标准溶液中相当的氮的质量18蛋白质换算系数不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为为15%~17.6%，有的上下浮动。

18=N×6.25=蛋白质含量2020消化炉三、半微量凯氏定氮法23蒸馏吸收装置三、半微量凯氏定氮法2424三、半微量凯氏定氮法2525三、半微量凯氏定氮法2626三、半微量凯氏定氮法272728计算28X:样品中蛋白质的含量，%；

V1:样品消耗盐酸标准液的体积，ml；

V2

:试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml；V:样品定容总体积，mL;

c:盐酸标准溶液的浓度，mol/L；m:样品的质量(体积)，g(ml)；

F:蛋白质换算系数;

0.014:mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；注意事项及说明1、所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。2、蒸馏装置不能漏气。3、样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。4、消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。295、样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。6、

若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。7、

样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。308、—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品。如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。9、消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。3110、向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这是由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀；有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。11、硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。12、蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源。否则可能造成吸收液倒吸。3233蛋白质测定仪---滴定34KDN型蛋白质测定仪

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现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。讨论振摇大火加热消化2h后，估计消化完全量NaOH少38怎样区分是否加入含氮物?在凯氏定氮法测定样品的总含氮量之后,再取一份样品,先用三氯乙酸处理样品,让蛋白质形成沉淀。过滤后,分别测定沉淀和滤液中的氮含量,就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的物质的氮含量。皮革奶

皮革水解蛋白的检测难度比三聚氰胺更大，因为它本来就是一种蛋白质。目前农业部规定的检测方法，主要是检查牛奶中是否含有皮革水解蛋白，这是动物胶原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦验出，则可认为含有皮革水解蛋白。

所谓皮革水解蛋白粉，是指利用皮革生产过程中部分不能使用的皮革、毛发、毛囊等物质，甚至是动物屠宰场所收集的毛发类物质，通过化学方法加工，使之水解成为蛋白质。这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程中带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者药品级的添加剂。通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。四蛋白质的快速的测定法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有害气体污染环境，影响操作人员健康。新开发的：

双缩脲法、

福林-酚比色法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法、水杨酸比色法等421、双缩脲法NH2—CO—NH—CO—NH2

+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2△150~160℃双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。紫色络和物。43442、福林-酚法（双缩脲法的发展）两步反应(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。A750(3)灵敏度高，酚类及柠檬酸对本法有干扰。451、双指示剂甲醛滴定法

氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。46五氨基酸定量测定双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂同时取两份样①+中性红，用NaOH滴定

(6.4红-8黄)②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定

(9.3无-10.5蓝)47琥珀色氨基酸态氮（%）式中c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014——氮的毫摩尔质量，g/m

482、电位甲醛滴定法

根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定的终点。pH8.29.249

在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL,加入10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2时，消耗标准碱液10.12mL,同法作空白实验，滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液0.08mL,加入甲醛后滴定至pH9.2时，消耗标准碱液0.90mL。问该样品的氨基酸态氮含量？0.645%你算对了吗？503、茚三酮的比色法原理：氨基酸在碱性条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物