乳剂类中药化妆品的制备和质量检测

内容一目的要求

内容二

实验原理

内容三仪器准备

内容四

配方及工艺

内容五成分解析

内容六产品检测与评价

内容七思考题

1.掌握人参精华润肤乳制备原理及各基质的作用。

2.学习人参精华润肤乳的制备方法。

目的要求实验原理

润肤乳顾名思义就是用于身体上的化妆品乳液，是一款富含胶原蛋白护肤品，具有补水、滋润、美白的基本功效。随着技术的成熟和发展，细分到可以让身体全身柔滑、瘦身、修复保养、香体迷人等多重功能。润肤乳不仅含含有和乳霜一样的成分，而且最大的特点是含水量高，含水量是乳霜的一两倍高。涂在皮肤上不仅能为皮肤迅速的补充水分，还可以为皮肤建构一层水润的皮脂膜，能防止水分流失，这种“锁水功能”是乳液最重要的功能之一。特别适合皮肤比较容易干燥的人群。

仪器准备

搅拌机，烧杯，电炉（或水浴锅），温度计，托盘天平（或电子秤）。原料名称百分比%作用丙三醇3保湿丙二醇3保湿ß-葡聚糖0.5抗衰老、抗敏消炎、高效保湿去离子水至100.0增稠人参提取物2.0抗氧化、抗衰、保湿白芨提取物1.0防止皮肤开裂，抗氧化，鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯&山梨坦橄榄油酸酯0.4乳化剂、增稠剂、人参精华润肤乳配方A相原料名称百分比%作用苯氧乙醇0.6防腐剂维生素E0.2抗氧化、美白保湿清凉剂0.3肤感调节剂、清凉B相C相原料名称百分比%作用聚丙烯酸酯交联共聚物-62.5增稠剂、成膜剂鲸蜡硬脂酸3.0乳化剂、柔润聚乙烯2-乙基己基1.0成膜剂环五聚二甲基硅氧烷4.0成膜剂、柔润氢化聚异丁烯5.0成膜剂、乳化剂辛酸/癸酸甘油三酸酯3..0柔润剂、溶剂棕榈蜡0.5成膜剂霍霍巴油3.0保湿剂、柔润

工艺（1）将A1—A2一同置另一烧杯内,冷泡静置，待溶解完全后加入A3—A7作烧杯①；(2)称量B1—B8置于干燥烧杯内,电炉将烧杯加热至60℃-70℃,使全熔，作烧杯②，烧杯②持续加热保持温度；(3)待烧杯①溶解完全后，将烧杯①加热至50-60℃，随后趁热将烧杯②缓慢搅拌且倒入烧杯①中，搅拌成均匀乳液状；(4)最后加入C1—C3，搅拌均匀即可。鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯&山梨坦橄榄油酸酯：原料产品属于无溶剂制造、无防腐剂安全性较高的一类。象牙白、片状（不沾、方便使用），熔点在65-75℃。所使用的原料符合ISO16128-1：2016，属绿色原料。易于生物降解，无毒。无皮肤刺激性（贴片试验）、无潜在刺激（红细胞试验）、无产生粉刺的潜在威胁。乳化和增稠性能优异，且与防腐剂、盐的配伍性更佳，在化妆品中常被用作乳化剂、增稠剂和肤感调节剂。此外，还有渗透促进、抗皮肤发红、提供皮肤保护屏障等作用；丙三醇：又名甘油，在化妆品、护肤品中主要作用是溶剂、保湿剂，风险系数为2，比较安全，甘油没有致痘性。保湿、柔软、卸妆溶剂及润滑剂。绝不可以直接使用未经稀释的100％纯甘油，不仅不会保湿，还会造成反效果。甘油具有吸水作用，保湿护肤品常常用它吸附空气中的水分子，令其覆盖在皮肤的角质层，从而达到保湿的效果，100％的甘油很容易受到空气中湿度的影响，湿度较低的季节或环境，甘油在空气中吸收不到足够的水分，反而会从肌肤真皮中吸取水分；成分解析：丙二醇：别名1.2-丙二醇，在化妆品护肤品中主要是保湿剂、溶剂，丙二醇是多元醇的一种，几乎无色无臭，无油腻感，并完全溶于水，亦有防腐作用。丙二醇作为滑爽剂使用渗透性强，能帮助其他成分在皮肤表面涂开并渗入，但是作为保湿剂时抓水比例没有甘油好。丙二醇成分适合非色素性皮肤、耐受性皮肤、干性皮肤、紧致皮肤4种皮肤类型；β-葡聚糖：在化妆品护肤品中主要起到抗衰老、抗敏消炎、高效保湿等作用。皮肤的衰老有内在和外在的因素：内在因素则是身体缺乏维持细胞足够的再生速度而发生的自然衰老过程；外界因素则是包括紫外线所导致的光老化、外界的刺激和炎症、环境污染、生活压力等。市面上在售的抗衰老化妆品大都添加外源性活性物，乳防晒剂、自由基清除剂、保湿剂等等，从而达到延缓衰老的效果，而β-葡聚糖是从根本上改善皮肤细胞的天然生物活力，并与皮肤的自然更新过程起到协同作用人参提取液：人参提取液是十分重要的中草药成分，人参提取液在化妆品护肤品中主要作皮肤调理剂、抗氧化剂、头发调理剂。人参可以明显抑制脑和肝中过氧化脂质的形成，减少大脑皮层和肝中脂褐素的含量，同时也能增加超氧化歧化酶和过氧化氢酶在血液中的含量则具有抗氧化作用，如rg3、rg2、rb1、rb2、rd、rc、re、rg1等可以不同程度的减少体内自由基含量；此外，人参提取液还有多种维生素、氨基酸、营养素，可以增加细胞的活力，延迟衰老，还可以抵制黑色素的生产。应用于医药保健行业，可以配制成抗疲劳、抗衰老以及健脑的保健产品。在美容化妆品行业，可以配制成祛斑、减少皱纹、活化皮肤细胞、增强皮肤弹性的化妆品。除此之外还可以用于食品添加剂。一般可被调成栓剂、洗剂、注射剂、片剂、胶囊白芨提取物:白芨根提取物在化妆品、护肤品里主要作用是皮肤调理剂，美白祛斑，风险系数为1，比较安全，可以放心使用，对于孕妇一般没有影响，白芨根提取物没有致痘性。白芨提取物对5a-还原酶有抑制作用,说明提取物对因雄性激素偏高而引起的脱发会有很好的防治作用,可用于生发、粉刺制品;白芨提取物还是效果明显的抗氧剂、皮肤美白剂和抗炎剂。聚丙烯酸酯交联共聚物-6：原料在化妆品中主要作用是增稠剂、成膜剂，伴有非常高的缔合作用的聚电解质聚合物，可以较大程度的地域电解质给配方带来的破坏，同时有很好的悬浮稳定能力，适合含有颗粒的透明体系、超流动及霜状凝胶等各种配方；鲸蜡硬脂酸：鲸蜡硬脂酸在化妆品、护肤品中主要作用是乳化剂、增稠剂、柔润剂。鲸蜡硬脂酸属于脂肪醇，外观为白色蜡状物，能提供奶油状质地，可人工合成，也可从椰子脂肪醇中提取。该成分能帮助产品更容易渗透到皮肤当中，还能作为乳化剂使用，是产品更易涂抹，FDA也允许在食品中添加，故其安全性较高；棕榈蜡：棕榈蜡在化妆品中主要用作成膜剂，棕榈蜡是从棕榈树叶上提取的天然植物蜡，主要是棕榈酸蜂酯和蜡酸。棕榈蜡稀薄而粘滞度小，树脂含量低，涂布均匀，流动性好；聚乙烯2-乙基己基：在化妆中主要充当成膜剂，原料为不透明油脂状，有微弱的油脂味，涂布在皮肤上均匀爽滑且不油腻，柔润性能佳。成膜效果好，通常只需要少量添加就能达到很好的成膜效果；环五聚二甲基硅氧烷：在化妆品、护肤产品中产用作增稠剂、柔润剂。该成分无色无味，且具有一定的挥发性，常添加于精华、乳液、粉底、妆前乳、及护发素中，可以产生润滑丝滑的感觉；氢化聚异丁烯：在化妆品、护肤品中常用作增稠剂、成膜剂、粘度控制剂。氢化聚异丁烯具有天然角鲨烷的化妆品特性，因而被称为合成角鲨烷，是无色无味无毒的高纯度液体。可用于化妆品和药品的油相成分，滋润而不油腻，保湿润滑，渗透力强，和天然角鲨烷的性质非常相近，热稳定和存储稳定性良好，使用时易于乳化，无刺激性和过敏性；辛酸/癸酸甘油三酸酯：在化妆品中主要用作柔润剂、促进渗透剂、溶剂。该成分是高清爽的无味油脂，属棕榈油或椰子油的衍生物，他是使用热分馏方法提取而成。由于他和人体皮肤有兼容的特征，具有不油腻质感，加入乳霜或乳液中可改善其延伸性，有润滑和使肌肤柔软的效果，并有过滤紫外线的功能，为椰子中的提取物；霍霍巴油：具有不易被氧化、耐高温、高压、粘度变化小等特点，其触觉和延展性也比其他植物油好，可以使皮肤柔软、有弹性，且易被皮肤吸收，是化妆品中出色的油剂、滋润剂和保湿剂；苯氧乙醇：苯氧乙醇多作为防腐剂、抗菌剂。略有芳香气味，80℃以下稳定，ph在3-10范围内稳定有效，可与阴阳离子表面活性剂配伍，在高乙氧基化合物中会失活。易添加至各类配方中，苯氧乙醇的防腐机理：引起微生物膜的通透性丧失，导致细胞内容物渗出，丧失电子动力产生的能量；维生素E：维生素E也叫做生育酚，是一种脂溶性维生素，也是优良的抗氧化剂。天然维生素E易被皮肤吸收，可以促进皮肤新陈代谢、防止色素沉积、改善皮肤弹性、滋润皮肤，起到美容、护肤、抗衰老的作用；还可以阻止亚硝胺类致癌物，防止或延缓其中的油脂酸败；清凉剂：清凉剂能带来持续且高效的清凉感觉，同时不会受到高温的影响。且该清凉剂特点为新鲜、无刺激性辣味、无苦味，清新怡人以及用量低1、耐热耐寒检测操作步骤：（1）样品预处理。将产品用无损、洁净、大小适宜的包材灌装好，灌装到瓶口处。一般灌装2-3支。（2）将灌装完毕的样品贴上标签，一般标签内容包括但不限于：样品名称、样品负责人、样品检测项目和样品检测开始日期；（3）将处理完毕的样品置于恒温炉处，耐热耐寒恒定温度分别为40℃和-10℃；（4）待到7h、24h、48h、72h、1周、2周、1月、3月时，观察样品有无破乳分层，外观、气味、颜色、肤感有无变化等，分别记录其测试结果，无明显变化即为合格；2、离心检测操作步骤:（1）将样品装入离心士官至3/2处；（2）将（1）中的离心试管插入离心机，注意平衡；（3）打开电源开关，调转速至“2500转/分”，离心30分钟；（4）离心完毕，清理离心机；（5）观察样品有无破乳分层等不良现象即为合格；产品检测与评价：3、PH值检测操作步骤:1、使用仪器前的准备：仪器在电极插入之前输入端必须插入Q9短路扦，使输入端短路以保护仪器。仪器供电电源为交流电源，把直流稳压电源插在220V交流电源上，并把电极安装有电极架上后将Q9短路插头拔去，把复合电极插头插在仪器的电极插座上，电极下端玻璃球泡较薄，以免碰坏。电极插头在使用前应保持清洁干燥，切忌与污物接触。2、仪器pH的标定：2.1仪器使用前首先要标定（采用二点标定），一般情况更好仪器在连续使用时，每天要标定一次。2.2接通电源，打开电源开关，按“pH/mV”键，使仪器显示pH状态，预热30min。2.3按“温度”键，仪器进入溶液温度调节状态（此时温度单位℃指示灯闪烁），按“△”或“▽”调节温度，使温度显示值和标定溶液的温度一致，然后按“确认”键，仪器即确认溶液温度值后回到pH测量状态

2.4用蒸馏水清洗电极并用滤纸吸干，把电极插入pH=6.86的标准缓冲溶液中，并摇动使溶液均匀，按“定位”键（“定位”显示，并显示实测的mV值），待读数稳定后按“确认”键（此时显示实测的mV值对应的该温度下标准缓冲溶液的pH校准值），然后再按“确认”键，仪器转入“斜率”标定状态。2.5仪器在“斜率”标定状态下，用蒸馏水清洗电极并用滤纸吸干，把电极插入pH=4.00或pH=9.18的标准缓冲溶液中（用接近被测溶液PH值的标准缓冲液），此时显示实测mV值，待读数稳定后按“确认”键，（此时显示实测mV值对应的该温度下标准缓冲溶液的pH校准值），然后按“确认”键，仪器自动进入pH测量状态。3、测量pH值：3.1经标定过的仪器，即可用来测量被测溶液，用蒸馏水清洗电极，再用被测溶液清洗一次，用温度计测出被测溶液的温度值（当被测溶液与标定溶液温度不同时，需设置温度，步骤与2.2相同），然后把电极插入被测溶液内，摇动使其均匀，待读数稳定后读出该溶液的pH值。4.1仪器的输入端必须保持干燥清洁。仪器不用时，将短路插头插入插座，防止灰尘及水汽浸入。4.2测量后及时将电极保护套套上，套内应放少量补充液以保持电极球泡的湿润。切勿浸泡在蒸馏水中。4.3复合电极的外参比补充液为3mol/L氯化钾溶液，补充液可从电极上端小孔加入，复合电极不用时，盖上橡皮塞，防止补充液干涸。4.4数显PH计由国家计量部门定期检定，周期为一年，以保证仪器的准确性5注意事项5.1用缓冲溶液标定仪器时，要保证缓冲溶液的可靠性，不能配错缓冲溶液，否则将导致测量结果产生误差。结果判断：1、PH值的测定结果以两次测量的平均值表示，精确到0.1，平行实验误差应≤0.12、PH标准范围在:4.0-8.54、重金属检测

操作步骤:（1）用分析天平准确城区0.200g（±0.001g）样品与消解罐中，同时做试剂空白。若样品为未知样品则只称取0.100g进行消解。含有乙醇等挥发性物质的样品，应置于100℃水浴中挥发30min（注意不得蒸干）。在已称好的样品中加入7ml硝酸和1ml过氧化氢。（2）样品预处理。将（1）中装有配置好样品的消解罐置于智能控温加热器上以80℃恒温30min，以便确保消解完全、消解的安全性和检测结果的准确性；（3）微波消解。预处理完成后，冷却至室温，按KJ系列消解罐操作规范装置消解罐，进入消解程序；（4）消解程序设定。根据不同的检测仪器设定不同的使用参数；（5）消解完成后，按微波消解仪器的操作方法取出消解罐；（6）赶酸。将取出的消解罐打开灌盖，置于智能控温加热器上，130℃恒温至消解液少于1ml且未蒸干时，取出冷却；（7）定容。将消解液倒入比色皿中，用蒸馏水冲洗三次，定容到100ml，过滤后得到待测液；

（8）维护保养。每次工作结束后，都必须清洁温度传感器，及时清理炉腔内壁的污垢、水汽、酸气等，保持清洁干净；（9）其他注意事项。每使用30次后对导气管进行一次清洁。严谨遵循仪器的使用说明进行操作使用；电感耦合等离子体发射光谱仪使用：（1）冷开机(从仪器关闭状态开机（2）使用前打开电源预热4h，将仪器前部系统电源开关打开(绿色指示灯应亮)。（3）开计算机、显示器和打印机，进入操作系统。（4）开气气源阀，检查并调节减压阀于50kPa左右，气源纯度要求99.996％（5）开循环水，检查压力指示在50-310kPa之间，温度设定在20℃±1℃（6）将仪器后部高压电源开关打开(向上)（7）打开实验室排风系统。（8）安装样品导入系统（9）样品毛细管由端动泵外通道上卡口卡住再经下卡口，再进入雾化器，废液管由雾化室下出口接至动泵中间通道的上卡口卡住，再经下卡口流入废液接收桶，压上动泵压块调节动泵压力调节杆，使进样流速均匀，废液管路中有一段一段的气泡随废液流动。计算机软件操作：（1）在操作系统下，运行Icpexepertll，进入仪器页面，点火，进行矩管准直扫描、进行波长校正及观察仪器当前状态等（2）单击“工作表格”后，进入工作表格装载程序，进入工作表格界面，新建或打开工作表格，装载工作表格包括两种操作操作方式:新建用该对话框创建新工作表格。打开用该对话框可打开原有工作表格。建立新工作表格文件名按“新建”，创建并存储工作表格，进入新建工作表对话框。工作表格软件整个窗口包括三个页面方法页面、顺序面、分析页面（3）打开方法编器编辑方法(A择分析元素图B从元素周期表中单击要分析的元素C分析元素线选择完毕后，按确定。)选择分析谱线的条件，输入标准溶液浓度:A.进入方法编器的标样页面:B在标样数处输入标准溶液个数:C.在标准浓度栏的单位处选择浓度单位:D.在标准浓度栏的标样处输入每个标样的浓度值。存储该方法后返回方法编辑器页面，检查所选正确。如有误清除或重断编（4）设置顺序参数进样方式设置，在工作表窗口，进入顺序页面，若未配置自动进样器，确认进样方式(样品源)为手动。（5）输入样品信息:选择顺序器图标，进入序编器页面的样品和校正标样页面。在“多少个样品”项中输入样品数:在“如何在溶液清单中插入校正标样”项中选择“开始时进行曲线校正”和“曲线校正包括一个空自”:择“定”，将出现确认对话框（6）设置序参数:从顺序面选择“顺序参数”图标，弹出顺序参数工作根。按照实际情况做适当选择，包括:选择标准曲线校正失败时，所要采取的动作等选择确定出对话，当提示认选择时，选择是仪器优化和检查：（1）检查矩管安装正确，关矩室门，确认紧杆完全到位。(矩室门已关好)（2）检查进样管路安装是否正确检查或连接取样毛细管和废液管检查或安装好动象管检查进样毛细管是否已插入清洗液中:检查废液管是已放入废液容器中。点燃等离子体：（1）单击点燃等离子图标按F4健点燃等离子体，1CP观测位置优化进入断矩管准直顶面，(该方法采用257.610nh进行扫描)进5ppmWn溶液按炬扫描(TorchScan)按细进行向扫描，在方向栏里选择为垂直，再按矩扫描行垂直扫描，以确定最佳位置分析。（2）进入或切换到分析页面，选择分析标签，用鼠标单击样品标签单元，将要分析的溶液标签选成黄色，按“开始分析”且根据软件提示，逐个进样按确定进行分析，直至分析结束。冷关机：（1）用溶剂进样清洗雾化室数分钟，单击等离子体熄灭(或从分析菜单中进择关等离子体)等离子体熄灭后，蠕动泵将自动停止转动，关闭循环水，关闭气源，关闭附件，退出Icpexepertii软件，关闭计算机、排风等。为延长动泵管的使用寿命，每次工作结束应将泵管从动泵上松开，并将动压臂松开。结果判定：当测定结果为:铅含量≤40mg/kg；汞含量≤1mg/kg（含有机汞防腐剂的眼部化妆品除外）；砷含量≤10mg/kg即为合格产品。5.微生物指标样品预处理：（1）疏水性的样品，称取10g，加到灭菌的研钵中，加10m灭菌液体石蜡，研磨成粘状，再加10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40~44℃水溶中充分混合，制成1:10的稀释液。细菌总数的测定：（1）将配好的卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基熔化后，放在灭菌锅内灭菌后，取出，放在45~50℃的恒温水箱内待用，需用时，取出，将培养基倒入平皿内，每皿约15L，另在一个不加样品的灭菌空平皿内注入培养基，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，在37℃恒温培养箱内培养48h后从培养箱内取出观察。菌落计数方法及报告：（1）先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5-10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。（2）首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范国当只有一个释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数，若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定若其比值小于或等于2应报告其平均数若大于2则报告其中较小的菌落数。（3）若所有稀释度的平均南落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均南落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（4）若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相部的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。（5）菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。霉菌和酵母菌数的测定：（1）做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将至45℃左右的孟加拉红培养基注入平皿中特，待琼脂凝固后，倒置于25-28℃温箱中，3天后开始观察，共培养观察5天（2）计算方法:通常选择菌落数在10-150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母菌数，报告:每克(或毫升)样品所含霉菌和酵母以个/g(个/mL)表示。（3）可参考GB4789，28食品卫生微生物学检验一染色法、培养基和试制国家食品药品监督管理总局《化妆品安全技术规范》(2015年版)中霉菌和酵母菌数金黄色葡萄球菌的测定：（1）增菌培养完成后检查经过预处理的样品中是否有菌落生长，若有菌落生长的话，将菌悬液划线在BP(或VJ)平板上，将划线后的平放入37.0℃培养24~48小时。（2）分离纯化:金黄色葡萄球菌的落在BP培养基上生长为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周为一混浊带，在其外层有一透明带。挑取单个落分纯在琼脂平板上，置37℃培养24H。（3）染色镜检:挑取分纯落，涂片，进行革兰氏染色，镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性電萄球菌，菌体较小，直径为0.5-1um。（4）甘露醇发酵试验:取述分纯落接种到甘露醇发培养基中，置37℃培养24h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。（5）血浆凝固酶试验:取清洁载玻片，一端滴加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌若混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有固现象，再进行试管凝固试验（6）检验结果报告:BP板上若无可疑菌落生长，则报告无金黄色萄球菌。凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露产酸。血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球。（7）可参考【GB7918.5-87化妆品生物标准检验方法金黄色葡萄球菌的测定。大肠杆菌的测定：（1）取10m11:10稀释样品，加到双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置37℃培养24-48h，如不产酸也不产气，则报告为大肠杆菌阴性，（2）如不产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18-24h同时取该培养液1-2滴接种到蛋白胨水中，置4℃培养24h。经培养后，在上述平板上观察有无典型杆菌生长。大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽;也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽或成粉紫色，中心较深的杆菌，亦常为大杆杆菌，应注意挑选。挑取上述可疑菌落涂片作革兰氏染色镜检：（1）在蛋白胨水培养液中，沿管加入基质试剂约0.5ml，轻摇试管，观察靛基质反应。阳性者液面呈政现红色;阴性反应液面呈试剂本色（2）检验结果报告:EMB板上若无可菌落生长，则报告无大菌落:平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌，靛基质试验性，则可报告被检样品中检