高效液相色谱-串联质谱法测定竹笋中丁烯氟虫腈残留

高效液相色谱-串联质谱法测定竹笋中丁烯氟虫腈残留

竹笋细腻、酥脆、爽口。自古以来，人们就认为它是蔬菜的瑰宝。但近年来,南方地区雷竹笋和麻竹笋的生产长期受到金针虫的危害。丁烯氟虫腈是在N-取代苯基吡唑类化合物基础上通过结构修饰而形成的低毒苯基吡唑类化合物,因其对金针虫等多种害虫具有较高的活性,目前广泛应用在蔬菜、果树和竹笋等作物上并获得理想的杀虫效果。随着生活水平的提高,食品安全问题越来越受到人们的广泛关注。然而,现有竹笋中的农药残留检测研究均集中于有机磷和有机氯等常见或已被禁用的农药方面,一些新型的杀虫剂如丁烯氟虫腈等的残留鲜有报道,随着竹笋产量和出口量的增加,这些农药残留检测也日益受到关注。目前,丁烯氟虫腈农药残留的分析方法主要为气相色谱法和气相色谱-质谱联用法。但由于气相色谱在低含量情况下缺乏足够的确证依据,易造成假阳性;同时由于丁烯氟虫腈具有一定的热不稳定性,应用气相色谱和气相色谱-质谱法具有一定的局限性。而HPLC-MS/MS由于具有高效的分离能力和精确的定性、定量等特点,目前已广泛应用于多种农药残留的检测,但尚未见应用于丁烯氟虫腈农药残留检测的文献报道。本实验采用高效液相色谱-串联质谱法检测竹笋中的丁烯氟虫腈残留量,研究了样品的提取、净化以及液相色谱质谱联用检测方法,并将该方法用于实际样品的检测。本方法显示了较强的确证能力,且受基质干扰较小,能满足目前竹笋中丁烯氟虫腈农药残留的检测要求。1实验部分1.1仪器、试药和萃取QuattroPremierXE三重四极杆液质联用仪(美国Waters公司);Milli-QGradient(美国密理博公司);KQ3200超声波清洗器(江苏昆山超声仪器公司);T25Digital高速均质机(德国IKA);AB104-S0.1mg分析天平(瑞士梅特勒公司);MTN-2800W氮吹仪(天津奥特赛恩斯);固相萃取装置(美国安捷伦公司);Primarysecondaryamine(PSA)固相萃取小柱(美国CNW公司)。乙腈(农残级)、甲酸(色谱纯)、乙酸铵(色谱纯)均购自美国天地公司;丁烯氟虫腈标准品(大连瑞泽农药股份有限公司)、氟虫腈标准品(中国标准物质中心)。1.2材料表面毛竹笋和雷竹笋由中国林科院亚热带林业研究所提供;麻竹笋由福建漳州华安林业局科技中心提供。1.3实验方法1.3.1乙腈相的制备取新鲜笋可食部分样品切碎,用组织捣碎机绞碎成糊状,称取25g(准确至0.01g)样品于100mL具塞离心管中,准确加入乙腈40mL、无水硫酸钠5g,于高速均质机中均质120s后,经中速定性滤纸过滤至50mL具塞离心管中,用10mL乙腈冲洗滤渣,合并滤液至盛有6gNaCl的50mL具塞离心管中,剧烈振荡1min,静置5min,待分层后,取乙腈相在40℃水浴中旋转蒸至近干,氮气吹干。用4mL乙腈充分溶解残余物,上样于PSA固相萃取柱(预先用5mL乙腈平衡)净化,收集流出液,氮气吹干,用乙腈定容至1.0mL后,用0.22μm滤膜过滤至进样瓶中,供HPLC-MS/MS分析。1.3.2u3000定性密度HPLC条件:色谱柱:WatersAtlantisT3色谱柱(2.1mm×150mm×5μm);流动相A为0.1%甲酸水溶液(含5mmol/L乙酸铵),流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0~5min,20%~90%B;保持2min;7~13min,90%~20%B,保持2min。流速:0.3mL/min;柱温:35℃;进样量:10μL。质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI),负离子扫描多反应监测(MRM)模式,温度为110℃;毛细管电压为3.80kV;脱溶剂气温度为350℃;干燥器流速:12mL/min;雾化器压力:50psi。1.3.3基质匹配标准溶液质谱条件的测定在负离子模式的测定条件下,分别将加入内标物质的样品溶液和基质匹配标准溶液注入液相色谱-串联四极杆质谱仪进行测定,以其基质匹配标准溶液峰的保留时间和2对质谱监测离子对为依据进行定性,以定量离子对的峰面积计算样品中待测物的含量。2结果与讨论2.1乙酸铵用量对丁烯氟虫腈响应值的影响丁烯氟虫腈结构缺乏酸性或碱性基团,在溶液中较为稳定,不易形成离子,因而较难离子化。依据电喷雾电离的机理,以利于化合物去质子化的乙腈为有机相,同时在流动相中加入适量的乙酸铵,可改善该类化合物在负离子模式下的离子化效率。实验表明,加入5mmol/L乙酸铵能有效提高丁烯氟虫腈的响应值。采用流动注射的方式将目标物标准溶液直接注入质谱仪,进行全扫描,质量扫描范围(m/z):100~500,得到一级质谱图和准分子离子峰[M-H]-(母离子)。参考欧盟指令(2002/657/EC),以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描,选择丰度较高的两个碎片离子作为定量和定性离子,组成监测离子对,碰撞能量为40eV和39eV;碰撞气流量为0.15mL/min;丁烯氟虫腈的母离子为m/z488.9,子离子为m/z288、249.9,其中m/z288为定量离子(内标物质氟虫腈的母离子为m/z435,子离子为m/z25、330,其中m/z330为定量离子)。丁烯氟虫腈的典型离子流色谱图见图1。2.2柱对提取回收率的影响丁烯氟虫腈属于N-取代苯基吡唑类化合物,不溶于水,易溶于丙酮、乙腈和乙酸乙酯等溶剂。分别采用甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮-正己烷(1∶1)等溶剂对竹笋中丁烯氟虫腈的提取效果进行比较,提取回收率结果如图2所示。二氯甲烷和乙酸乙酯因与水的互溶性差,与丁烯氟虫腈的接触面较小,导致回收率较低;甲醇因对丁烯氟虫腈的溶解度较差,回收率也较低(均小于70%)。丙酮、乙腈和丙酮-正己烷(1∶1)的提取回收率相对较高(均大于85%)。但丙酮提取的杂质较多,重复性较差,且丙酮为易制毒化学品,对人体危害较大。综合考虑采用乙腈作为提取溶剂。进一步考察了PSA固相萃取小柱、弗罗里硅土固相萃取小柱、氨基固相萃取小柱、PestCarb固相萃取小柱、中性氧化铝固相萃取小柱和C18固相萃取小柱对竹笋中丁烯氟虫腈提取液的净化效果,实验结果如图3所示。结果显示,C18固相萃取小柱和PestCarb固相萃取小柱因其较强的吸附作用,去除杂质效果最佳,但目标化合物的损失较大。而由于竹笋中色素等杂质含量较少,PSA固相萃取小柱、弗罗里硅土固相萃取小柱、氨基固相萃取小柱和中性氧化铝固相萃取小柱对目标化合物和杂质的吸附作用相对较弱,因此回收率较好(回收率均大于85%)。通过比较过柱后样品的总离子流图,发现经过PSA处理的样品,其谱图基线平稳,目标物色谱峰的信噪比(S/N)为370,高于其他小柱处理的样品。因此,本实验采用PSA固相萃取小柱净化提取液。2.3质谱检测条件的确定尽管样品经乙腈提取和固相萃取后得到了良好的净化效果,但仍无法完全消除其基质效应。基质效应主要由基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争造成,包括基质增强效应和基质抑制效应。在液相色谱-质谱的定性定量分析中,基质效应影响仪器的灵敏度和重复性,是影响准确定性及定量的重要因素。因而在建立HPLC-MS/MS检测方法时应考虑基质效应的影响并采取措施进行消除,以保证结果的准确可靠。实验表明竹笋基质对丁烯氟虫腈的测定有干扰,为消除基质效应,除改进样品净化手段外,最佳方法是使用同位素内标(理化性质与目标物几乎一致),但同位素内标较难获得且价格不菲。综合考虑,本方法采用与丁烯氟虫腈结构较为相似的氟虫腈作为内标,配制基质匹配内标标准溶液的方法,可很好地消除基质影响,结果满足残留检测的要求(如图4所示)。2.4标准曲线与检出限准确吸取丁烯氟虫腈标准储备液适量,用空白竹笋基质溶液稀释成质量浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0μg/L的系列标准溶液。按浓度由低到高的顺序进样,在选定的色谱条件和质谱条件下测定,建立基质匹配内标校准曲线,进行线性回归计算。以基质匹配标准工作溶液中丁烯氟虫腈的质量浓度(X,μg/L)为横坐标,定量离子对的峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,结果表明,丁烯氟虫腈在5.0~100.0μg/L的浓度范围内线性关系良好,线性方程为Y=58.23X+21.34,相关系数(r)大于0.9948。以最低检出浓度计算,3倍信噪比为检出限,10倍信噪比为定量下限。竹笋中丁烯氟虫腈的检出限为0.21μg/kg,定量下限为0.69μg/kg。检出限高于气相色谱质谱联用的0.001mg/kg和气相色谱的0.01mg/kg。2.5加标回收率试验以不含目标分析物的样品进行精密度和加标回收率试验。为考察该方法的准确性,将每种样品取3份,分别添加不同体积的标准溶液,按照“1.3.1”进行样品前处理,在“1.3.2”色谱条件和质谱条件下测定,计算样品加标回收率,结果如表1所示。该方法的相对标准偏差(RSD)为3.2%~9.9%,样品的回收率为76%~103%,表明该方法的精密度和回收率比较良好。2.6质谱条件的验证根据欧盟指令(2002/1657/EC)规定的在应用质谱仪对目标化合物进行确证时的评价准则(即低分辨率质谱需满足4分),本实验选取1个母离子(1分)和2个子离子(各1.5分)对各化合物进行确证。在本实验条件下,丁烯氟虫腈的检测结果符合对目标化合物的确证准则。样品溶液和标准溶液均按优化后的色谱和质谱条件进行测定,根据色谱峰的保留时间和对应两对离子对的丰度比确定样品中是否存在丁烯氟虫腈。2.7实际样品测定和质控样品的制备为验证该方法的可靠性,从市场采购了雷竹笋、毛竹笋和麻竹笋,进行实际样品测定,同时作质控样品。结果在这些样品中均未检出丁烯氟虫腈农药残留,质控样品的回收率等指标均达到分析