苦瓜提取物抑菌活性的研究

苦瓜提取物抑菌活性的研究

作为一种常见的蔬菜，它在中国资源丰富，品种繁多。在民间苦瓜药食两用已有几千年的历史。近年来的研究也表明苦瓜具有很高的药用功效,如降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗虫、抗菌等。苦瓜中含有的抑菌活性成分,主要是苦瓜皂苷、黄酮、多酚、蛋白、多糖、精油,但其抑菌功能研究甚少。随着人们对食品安全越来越重视,天然防腐剂以其更高的安全性逐渐受到青睐。另外,许多临床病菌对抗生素表现出越来越强的抗性,从天然植物中寻找抑菌活性先导物质然后加以改良也是一种应对耐药微生物的新思路。因此,从苦瓜中寻找和开发天然防腐剂、抗菌剂,具有重要的研究意义。本实验选取食品工业中几种常见微生物菌种,包含革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌,采用活性示踪法,对苦瓜提取物的抑菌活性进行了研究,并对抑菌活性实验的评价方法进行了比较,旨在对苦瓜的抑菌功效进行探讨。1材料和方法1.1实验仪器与设备鲜苦瓜广西农业科学院蔬菜研究所提供;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉、青霉本学院微生物实验室提供;马铃薯培养基;牛肉膏蛋白胨培养基。超净工作台苏州净化设备有限公司;恒温培养箱广东韶关科力实验仪器有限公司;手提式杀菌锅上海三早医闻器械有限公司;电热鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司;数显恒温水浴锅北京市医疗设备厂;旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司;电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;台式高速离心机中国科学院武汉科学仪器厂;FreeZone2.5L真空冷冻干燥机美国Labconcog公司;XW-80A漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司;显微镜梧州光学仪器厂。1.2实验方法1.2.1原材料预处理1.2.2抗菌试验1.2.2.1.细菌激活挑取斜面菌种,接种于斜面试管中,细菌放于30℃恒温培养箱,酵母和霉菌放于37℃恒温培养箱,培养2d,活化备用。1.2.2.细菌和酵母细菌采用麦氏比浊法计数,酵母和霉菌采用显微镜血球计数板计数,用无菌生理盐水将细菌和酵母稀释成浓度为106cfu/mL。配制霉菌孢子悬浮液时,先用纱布过滤掉菌丝,再用0.1%(v/v)的吐温80水溶液将霉菌稀释为106cfu/mL的孢子悬浮液,注意显微镜计数和抑菌实验前用涡旋仪混匀。1.2.2.3.抗菌方法1.2.3苦提取的制备1.2.3.1.称取适量苦干，用70%乙醇,料液比1∶20,500w超声功率,50℃提取50min,过滤,50℃旋蒸至干,得到苦瓜提取物。1.2.3.超声功率的选择以料液比1∶15,分别以水、70%乙醇、乙酸乙酯为溶剂,350w超声功率,50℃提取50min。水提物5000r/min离心30min后取上清液,70%乙醇和乙酸乙酯提取物过滤后减压浓缩,再真空冷冻干燥,密封储存于冰箱中备用。1.2.4实验设计1.2.4.苦瓜提取物的制备称取50、60℃下烘干得到的苦瓜干粉各10g,采用1.2.3.1的方法制备苦瓜提取物,用70%乙醇定容至10mL,配制成浓度为1.0g/mL(以苦瓜干粉计)。用滤纸片法做抑菌实验,考察不同预处理温度对苦瓜抑菌效果的影响。为排除溶剂对抑菌作用的影响,同时对70%乙醇做抑菌实验,以下同。1.2.4.不同浓度的提取物的抑菌效果称取苦瓜干粉10g,采用1.2.3.1的方法制备苦瓜提取物,用70%乙醇配制成1.0、0.6、0.2g/mL三个浓度(以苦瓜干粉计),对三个浓度的提取物用滤纸片法做抑菌实验,比较不同浓度提取物的抑菌效果。1.2.4.抑菌圈测定称取苦瓜干粉,每份10g,采用1.2.3.1的方法制备苦瓜提取物,用70%乙醇定容至10mL,配制成浓度为1.0g/mL(以苦瓜干粉计),分别采用滤纸片和牛津杯法做抑菌实验,测量抑菌圈。每种方法做四次平行,序号1、2、3、4,对实验结果进行方差分析,比较两种抑菌活性评价方法。1.2.4.溶媒的配制与抑菌a.样品制备每份称取20g苦瓜粉,分别用水、70%乙醇、乙酸乙酯三种溶剂,按1.2.3.2的方法制备苦瓜提取物,冷冻干燥后以合适的溶媒配成200mg/mL。b.抑菌实验溶媒的选择取上述三种溶剂提取物少许放入小烧杯中,分别以水、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、DMSO为溶剂,溶解提取物样品,采用牛津杯法做抑菌实验,选择溶解性好且无抑菌活性的溶剂作为溶解样品的溶媒。c.抑菌实验对1.2.4.4a中的三种溶剂提取样品采用牛津杯法做抑菌实验,比较不同溶剂提取物的抑菌效果。1.2.4.不同提取方法每份称取20g苦瓜粉,以70%乙醇为溶剂,分别用室温浸提48h,350W超声功率50℃提取50min,50℃水浴回流提取4h三种提取方法,按1.2.3.2的方法制备苦瓜提取物。冷冻干燥后以1.2.4.4b中合适的溶媒溶解样品配成200mg/mL,采用牛津杯法测试抑菌活性,比较不同提取方法的抑菌效果。1.2.4.抑菌性实验对桂农科三号、碧珠六号、碧特111号三个苦瓜品种,分别称取20g苦瓜干粉,以70%乙醇为溶剂,按1.2.3.2的方法制备苦瓜提取物,冷冻干燥后以1.2.4.4b中合适的溶媒溶解样品配成200mg/mL,采用牛津杯法做抑菌实验,比较不同品种的抑菌效果。2结果与分析2.1苦瓜汁热稳定性由图1可知,预处理温度为60℃时,苦瓜片自然浓绿、色泽光亮,抑菌效果强于50℃,说明苦瓜中抑菌组分热稳定性较好,与何煜波的研究苦瓜汁热稳定性强,张雁的研究苦瓜水提物在100℃内抑菌活性稳定的研究结果一致。溶剂70%乙醇无抑菌圈。2.2抑菌圈直径测定由图2可知,当苦瓜提取物浓度增加时,抑菌圈直径也随之增加:在0.2~1.0g/mL范围内抑菌效果与样品浓度呈现出量效关系;在0.2~0.6g/mL浓度范围内抑菌圈直径增幅大于0.6~1.0g/mL,随着浓度的增加抑菌圈直径增幅趋于平缓。根据一般药物的量效曲线规律,可知随着样品浓度增加,抑菌圈直径将逐渐接近最大效应所对应的抑菌直径。1.0g/mL时抑菌圈直径较大,相对误差比0.2、0.6g/mL更小,所以选择1.0g/mL浓度做抑菌实验比较合适。2.3抑菌圈直径测定结果由表1~表3可知,相同浓度下,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都有F>F0.05临界值,两种方法存在显著性差异,牛津杯法对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径重复测量的平均值分别为15.57、13.35mm,滤纸片法对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径的重复测量的平均值分别为11.40、10.22mm。金黄色葡萄球菌滤纸片法方差为0.61,大于牛津杯法的0.15,枯草芽孢杆菌滤纸片法方差为0.47也大于牛津杯法的0.13。实验中两种抑菌方法操作都比较简便,滤纸片法消耗样品量比牛津杯法少,牛津杯法测量结果平均值更大、更稳定、相对误差小,这可能是滤纸片法在滤纸片制作,样品浸泡时滤纸片的样品含量上难以控制,滤纸片中的样品主要依靠培养基进行扩散,滤纸片挥干程度难控制,这对样品在培养基中的扩散存在影响,而牛津杯的规格和加样量都能很好地控制,样品也容易扩散。因此选择牛津杯法更好。2.4不同溶剂提取物的抑菌性能做体外抑菌实验必须使样品分散于溶剂中,具有一定的溶解度,才能通过扩散产生浓度梯度差,形成抑菌圈。由表4可知,苦瓜的水提物可溶于水、DMSO,不溶于无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯。苦瓜的70%乙醇提取物能溶解于水、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、DMSO。苦瓜的乙酸乙酯提取物不溶于水,能溶于无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、DMSO。对各溶剂做抑菌实验,结果见表5。由表5可知,以上选择的五种溶媒均无抑菌能力,可作为苦瓜提取物的溶媒。其中DMSO粘度大,且容易吸潮,不易操作,影响实验结果的稳定性;丙酮的沸点过低,极容易挥发,不利于样品在培养基中的扩散,故两者均未采用。后续实验中苦瓜水提物和70%乙醇提取物选用无菌水配制,乙酸乙酯提取物选择用乙酸乙酯配制进行抑菌实验。使用上述溶媒对苦瓜提取物进行抑菌实验,结果见表6。由此可知,对金黄色葡萄球菌的抑制能力依次是水提物>70%乙醇>乙酸乙酯;对枯草芽孢杆菌70%乙醇提取物的抑制能力最强,其次是乙酸乙酯提取物,水提物对枯草芽孢杆菌无明显抑制作用,可能是苦瓜中对金黄色葡萄球菌起抑制作用的物质为相对强极性的成分,对枯草芽孢杆菌起抑制作用的物质则为相对弱极性的物质。三种溶剂提取物对霉菌均未显示抑制作用。总体上,苦瓜各溶剂提取物对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和枯草杆菌起作用是主要的,只有乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和酵母检测出较弱的抑制作用,实验过程中水的极性大,易把糖类、蛋白质、无机盐等提取出来,提取液容易腐败变质,不易保存,也给分离工作带来困难,溶剂乙酸乙酯对苦瓜的提取率很低。考虑整体抑菌效果,后续实验选用70%乙醇作为提取溶剂。2.5抑菌圈和抑菌效果不同提取方法对抑菌效果的影响见图3。由此可知,超声波辅助法得到的苦瓜提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到17.31mm,对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达到14.01mm,抑菌效果最好,回流提取法次之,浸提法效果最差;各提取法得到的苦瓜提取物对大肠杆菌、酵母、青霉、曲霉都未显示抑菌圈。超声波在提取溶剂中产生的空化效应和机械作用可有效地破碎植物材料的细胞壁,使有效成分呈游离状态快速溶入提取溶媒中,还可以加速提取溶媒的分子运动,使得提取溶媒和苦瓜中的有效成分快速接触、相互溶合,可以增强提取效果,节省提取时间。2.6不同菌种抑菌圈检测称取桂农科三号、碧珠六号和碧特111号苦瓜干粉20g,用1∶15固液比的70%乙醇,350w超声功率,50℃提取50min,提取物真空冷冻干燥,用无菌水配成浓度为200mg/mL,采用牛津杯法测抑菌活性,结果如图4。由图可知,碧特111号苦瓜,对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达17.32mm,对枯草芽孢杆菌抑菌圈直径达14.00mm,效果最佳,碧珠六号次之,桂农科三号较差。这可能是由于不同品种苦瓜中抑菌活性成分的种类和含量存在差异。3.4贮藏、提取方法的确定3.1抑菌实验结果表明苦瓜提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有较强的抑制效果,而对大肠杆菌、酵母菌抑制作用很弱,而对青霉、黑曲霉无抑制作用。不同的苦瓜品种抑菌能力也不相同,本研究所用品种中碧特111号的抑菌能力最强。3.2苦瓜的预处理温度对其抑菌效果有一定的影响,本实验条件下选择60℃较佳;苦瓜提取物的浓度与抑菌效果有