不同预处理对结球甘蓝f

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结球杆子是十字花科最重要的蔬菜品种之一。这种异花授粉植物具有明显的杂种优势。但是,甘蓝为绿体春化植株,受条件限制一般1年只能自交繁殖1代,育成1个稳定的自交系至少需要7~8年时间。近年来常规育种的不足在实际工作中日渐明显。因此,各国学者开始寻找育种的新途径和新方法。游离小孢子培养技术即是刚刚兴起的一种加快育种进程的新方法。通过游离小孢子培养技术,即可在2~3年获得完全纯合的等基因纯系,这样便加快了选择速率,大大缩短了育种年限。同时,这一技术也使得隐性性状易于表达,丰富了育种资源。自1982年Lichter在芸薹属作物甘蓝型油菜游离小孢子培养上首次取得成功之后,有关甘蓝小孢子培养技术在育种方面的研究及其应用始终受到广泛关注和重视。近几年来通过科研人员的共同努力,甘蓝游离小孢子培养技术体系已初步建立。随后通过改进培养基配方、培养时添加激素、活性炭等,使得甘蓝游离小孢子培养技术逐渐趋于成熟。但目前仍有很多基因型存在游离小孢子出胚数低的问题,尤其在目标基因型中难以获得胚状体,这些都限制了小孢子培养技术在国内甘蓝遗传育种和基础研究中的进一步应用和深入发展。本研究拟在本实验室建立的甘蓝游离小孢子培养技术体系的基础上,进一步探讨影响胚状体产量的温度因素,旨在一定程度上提高小孢子胚状体的诱导率,为建立高效的甘蓝游离小孢子培养技术体系提供科学依据。1材料和方法1.1yr-心生/两种类型球的治疗所用甘蓝材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所甘蓝课题组选育或引进的10份杂种一代材料,其中扁球类型4份,分别为强力50(G1)、东升(G2)、09C2444(G3)、冬胜(G4);尖球类型3份,分别为YR-心生(G5)、09C3463(G6)、探春(G7);圆球类型3份,分别为KLU754(G8)、09C2542(G9)、中甘11(G10)。供试材料均种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所基地。2009年8月6日播种,9月8日定植于大田,12月10日各选6个种株移栽于塑料大棚。分别于2010月3月下旬至5月下旬进行游离小孢子培养。1.2方法1.2.1织带的制备选取适期花蕾,用75%的酒精消毒30s,之后用7%的次氯酸钠溶液消毒15min,再用无菌水冲洗3次,每次5min。将花蕾放入无菌研钵中,加入适量B5洗涤培养基,用研棒轻轻挤压,使小孢子从花药中游离到溶液中,经45μm孔径的尼龙筛网过滤后,收集滤液,100g离心3次,每次3min。最后1次离心后悬浮沉淀于NLN-13培养基中进行培养。1.2.232.5热压预处理将游离小孢子分装后分别在32.5℃条件下暗培养0h、24h、48h、72h,然后置25℃下继续暗培养。1.2.3高温预处理、暗培养将选取的花蕾在适当的保湿条件下于4℃冰箱中分别进行预处理24h、48h、72h,之后将游离小孢子分装后分别经32.5℃高温预处理0h、48h,最后于25℃下进行暗培养。以4℃预处理0h并32.5℃预处理0h为对照1(CK1)和4℃预处理0h并32.5℃预处理48h为对照2(CK2)。2结果2.1热激预处理对出胚的影响在7份有胚胎发生的基因型中,除G10外,都必须经过32.5℃热激预处理才能诱导小孢子胚胎发生。表1显示:基因型G10虽然在常温25℃培养条件下也能诱导小孢子胚的产生,但出胚数极低,每蕾仅为1.57个,而经32.5℃热激预处理的出胚数显著高于未经热激预处理。在不同热激时间的处理中,热激预处理24h、48h的出胚数都显著高于热激预处理72h;在热激预处理72h中,基本都为易出胚基因型出胚数显著降低,难出胚基因型表现为显著降低或抑制出胚;在热激预处理24h和48h的条件下,7份出胚基因型中,基因型G2热激24h的出胚数高于热激48h,G7为两者出胚数持平,其余均为热激48h的出胚数高于热激24h,其中难出胚基因型G9在热激24h时无胚胎发生,在热激48h时每蕾出胚数为0.97个,这对于难出胚基因型来说是一个难得的突破。总之,32.5℃热激预处理48h适于所有甘蓝供试基因型小孢子胚胎的发生。对热激预处理48h条件下所有供试基因型每蕾小孢子的出胚数进行方差分析,结果(表2)表明,供试的10份材料中,共有7份基因型产生了胚状体,且在有胚状体发生的7个基因型中,出胚数最低为每蕾0.20个,最高达每蕾34.37个,可见不同基因型间小孢子出胚数的差异达显著水平。同一基因型内不同小写字母表示差异达0.05显著水平。2.2预处理对诱导蓝水蓝松肉诱导结球蓝水的影响根据32.5℃预处理48h的小孢子出胚数的差异显著性,把所有供试基因型按每蕾出胚数多少划分为易出胚基因型(G10、G7)、较易出胚基因型(G4、G2)和难出胚基因型(G5、G9、G1、G3、G6、G8)3种类型(表2),分别选出易出胚基因型G10、较易出胚基因型G2和难出胚基因型G5进行4℃低温预处理试验。试验结果(表3)表明:单因素4℃低温预处理24h、48h、72h的试验中,与CK1相比,易出胚基因型G10在4℃低温预处理24h的出胚数高于CK1,48h、72h均低于CK1;在较易出胚基因型G2和难出胚基因型G5中,单独4℃低温预处理均不能诱导出胚。可见,4℃低温预处理对诱导甘蓝小孢子胚的发生无明显效果。表1显示,32.5℃热激预处理48h较适于所有供试基因型小孢子胚胎的产生。因此,本试验对4℃预处理24h、48h、72h和32.5℃预处理48h进行了组合预处理试验。试验结果(表3)表明:易出胚基因型G10在32.5℃预处理48h并4℃预处理24h、48h、72h的条件下,小孢子出胚数均低于CK2(单独32.5℃预处理48h),其中除与4℃预处理24h并32.5℃预处理48h相差不大外,其余均为随着4℃预处理时间的延长每蕾出胚数显著降低;在较易出胚基因型G2中,小孢子出胚数均显著低于CK2(单独32.5℃预处理48h);在难出胚基因型G5中,4℃预处理48h并32.5℃预处理48h的每蕾出胚数高于CK2。可见,4℃预处理并32.5℃预处理48h的组合预处理方式对诱导结球甘蓝小孢子胚胎发生的作用因基因型而异,但总体而言,4℃低温预处理对诱导甘蓝小孢子胚的发生无显著作用。不同小写字母表示差异达0.05显著水平。同一基因型内不同小写字母表示差异达0.05显著水平。3热激预处理对蓝水白液诱导的作用高温热激预处理能够改变小孢子的发育途径,使其从配子体发育途径转向孢子体发育途径,从而诱导小孢子胚的形成。但对于高温热激处理温度及时间,不同作物也不尽相同。Dias和Correia(2002)报道,在甘蓝游离小孢子培养中,最适宜的热激预处理温度和时间因基因型而异。一般认为,甘蓝小孢子培养在30~35℃条件下热激处理24~48h可明显提高胚状体的诱导率。本研究结果显示,甘蓝游离小孢子培养初期对小孢子给予32.5℃24h、48h的高温预培养能显著提高甘蓝小孢子胚胎的发生频率,其中32.5℃热激预处理48h更适于所有甘蓝供试基因型小孢子胚胎的发生,其每蕾出胚数高达34.35个。低温预处理的方法,在甘蓝型油菜、青花菜游离小孢子培养中被普遍采用,且在高效诱导胚胎发生方面取得了可喜的效果,但在结球甘蓝游