微藻定向培育技术对对虾微藻生长的影响

微藻定向培育技术对对虾微藻生长的影响

采用微藻定向培养技术，引入优质藻种，优化池浮植物群落的结构和功能，适应生物适应，改变养殖区的物理和化学性质因素，保持生态平衡。这是控制和预防高距离计算机系统疾病的重要方法。小环藻(Cyclotellasp.)隶属于硅藻门Bacillariophyta中心硅藻纲Centricae盘状硅藻目Discoidales圆筛藻科Coscinodiscaceae小环藻属Cyclotella,是对虾养殖中后期池塘常见的优势种,有利于对虾生长,可通过小环藻的定向培育进行对虾的生态养殖。虾池微藻定向培育和对营养盐的需求已有相关报道,小环藻对碳、磷、硅营养吸收动力学的研究亦有少量报道,但关于小环藻对辅助生长有机物质的需求方面未见报道。维生素、柠檬酸、乳精酸、烟酸、叶酸、葡萄糖、腐肉碱和氨基酸等物质对藻类的生长有辅助作用,称为辅助生长有机物质,它们在微藻的培养过程中能促进藻类细胞的生长繁殖,还能增强藻类细胞对环境的适应能力。鱼汁和海泥抽出液富含微藻生长必须的辅助生长有机物质,人尿是藻类生长的优质有机氮源,本文研究三者对小环藻生长的影响,为小环藻的定向培育和对虾养殖水域微藻生态调控防病技术的研究提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藻类的来源小环藻为广东海洋大学海洋生物研究所藻类研究室提供。1.1.2海水来源海水取自湛江市东风码头海区,经沉淀、砂滤及400目网滤后煮沸消毒,静置1d后使用。1.1.3烧瓶制备液鱼汁:将0.5kg海水鱼肌肉切碎,加1L海水浸泡,15d后使用,用时煮沸消毒。人尿:取人尿200mL,用烧瓶煮沸后备用。海泥抽出液:取自广东湛江东海大堤、比较肥沃又不淤黑的海泥,1份泥(以容量计算)加2份水,充分搅拌均匀,静置1～2min,取上层泥浆于铝锅中,按每1000mL泥浆加入NaOH1g的量加入NaOH,煮沸20～30min,煮时需不断搅拌均匀,煮后静置之24h吸取上清液使用。1.2方法1.2.1接种与培养实验用海水取自广东海洋大学的备用海水,相对密度为1.020,经沉淀、沙滤和煮沸,冷却后备用。早上8:00-9:00接种,培养容器为500mL锥形瓶,培养体积350mL,按比例添加实验所需的有机营养物质,在自然光照下培养,光照强度为2000～3000lx,温度为20～23℃,培养过程中每日振摇5次,保证微藻正常生长。基础培养液配方为湛江水产学院硅藻配方。1.2.2鱼汁添加量在预实验的基础上分别设置5个浓度梯度进行实验,实验设置2个平行组,以基础培养液为对照组,培养时间为8d。鱼汁添加量为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL;人尿添加量为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL;海泥抽出液添加量为3.0、6.0、10.0、15.0和20.0mL。1.2.3正交实验设计培养液为350mL,在单因子实验结果基础上设计了3因素3水平的正交实验,在单因子实验中生长最好的浓度范围,选择3个水平进行正交实验。1.2.4藻密度和od值的测定藻细胞密度的测定:先做光密度OD(A)和藻类细胞数相关曲线。将实验用藻液稀释成相关浓度,用722S分光光度计在660nm处测浓度组OD值,并将藻液用血球记数板计算其细胞数,反复5次,取平均值。结果表明,OD值与藻密度的线性关系良好。从接种日起,每2d定时取样1次,用722S分光光度计测定微藻660nm处的光密度值。以不加藻液的相同培养液为空白。1.2.5初始光密度值设定相对生长系数:K=(lgAt-lgA0)/T,At表示最终光密度值,A0表示初始光密度值,T表示时间。平均倍增时间(d):G=0.301/K。1.2.6统计分析运用Excel软件进行单因子方差分析处理。3结果3.1k值和对照组的生长效果鱼汁对小环藻的生长有明显的促进作用,但较高浓度的鱼汁会抑制藻细胞生长。表1显示,当鱼汁添加量为2～3mL时藻细胞的生长效果最好,K值较对照组升高了33.3%,G降低了34.9%;当鱼汁添加量为4mL时,藻细胞的生长速度减小,K值较对照组升高了6.7%,G降低了6.6%,随着添加的鱼汁的浓度升高,K值有下降趋势,鱼汁对小环藻生长的抑制作用加强。对其相对生长率进行单因子方差分析,F=25.01>F0.01(2,6)=8.75,差异为极显著。3.2生长情况对藻生长的影响小环藻培养基添加入低浓度的人尿后,其K值较对照组有明显的增长。表2表明,当添加量为10mL时K值最大,较对照组增加17.9%,G值下降了15.77%;而培养过程中无死藻出现,藻生长良好;但K值未能呈现递增趋势,可能与某种限制性因子或温度光照等环境因子影响有关。对其相对生长率进行单因子方差分析,F=15.64>F0.01(2,6)=8.75,差异极显著。3.3海泥多按g值的变化来计算k值海泥抽出液各浓度梯度较对照组都有明显的增长,各浓度组的K值显著高于对照组。由表3可见,当海泥抽出液浓度为20mL时,K值最大,较对照组增加35.6%,G值下降了25.15%。对其相对生长率进行单因子方差分析,F=34.43>F0.01(2,6)=8.75,差异极显著。3.4正交实验3.4.1正离子交换试验根据单因素实验的结果,在对小环生长具促进作用的浓度范围内,选取鱼汁、人尿、海泥抽出液三因素,每因素3个水平的基础上,以小环藻的相对生长率为指标,进行三因素三水平(表4)的正交试验L9(33)。3.4.2小环藻生长影响因子的确定表5显示,实验组7的K值比其他各组明显增加,G值比其他各组明显减少。直观分析的极差R值显示,小环藻生长的影响因子主要是海泥抽出液,其次是鱼汁和人尿。实验组7的组合是小环藻生长的最佳组合,即鱼汁、人尿和海泥抽出液的添加量分别为2.5、1.0、15.0mL时,小环藻的生长效果最好。3讨论3.1维生素a、c、e的添加量对小环藻生长率的影响以天然海水鱼为原料经发酵而制成的鱼汁成分十分复杂,主要含有蛋白质、氨基酸、磷脂、维生素和少量微量元素。陆田生认为浮游植物是海水中游离氨基酸的消耗者,即使在硝酸盐充足的情况下也会吸收它,氨基酸浓度是影响藻类生长率的重要因素;维生素在某些藻类的生长过程中也发挥着重要作用,成为限制藻类生长的主要因素之一。Swift认为,维生素在决定藻类种群结构中起主要作用,80%的甲藻的生长需要维生素B12;维生素B1和各种维生素的混合溶液对海洋原甲藻的增殖起促进作用。本研究结果显示,鱼汁添加量在2mL时对小环藻的生长有明显的促进作用,并出现明显的峰值;但添加量过大时,小环藻出现死亡的现象。笔者认为,不同种藻类对有机营养物质的需求有差异,在小环藻的培养中,添加适量的鱼汁,可提高小环藻的生长速度。3.2海泥切换液对藻类生长的影响海泥抽出液一般含有藻类生长繁殖所需要的各种微量元素和溶解有机物质,还含有某些辅助生长有机物质,且具有类似络合剂的作用,所以在培养液中加入海泥抽出液,实质上是解决了微量元素供应和加入了辅助生长物质的有效方法;碳水化合物是海泥有机质的重要组成成分,对小环藻的生长能提供一定的碳源。在高密度单细胞培养中,碳源就可能成为生长的限制因子,须添加碳肥;微量元素作为辅助因子参与生物的生化反应,促进藻类生长。陈贞奋认为,海泥抽出液对牟氏角毛藻促进增殖的效果比施用维生素好。本研究认为:海泥抽出液添加量在3～20mL能加快小环藻的生长速度。3.3不同的尿素利用情况组合人尿中95%是水,5%是可溶性物质及无机盐,其中大约2%是尿素。在藻细胞的氮代谢中,氮必须以NH4+的形式与细胞内的碳水化合物衍生的酮酸相作用生成氨基酸,然后再合成蛋白质。已经证实许多藻含有尿素酶,在它的催化下,尿素分解出氨被微藻利用;酶功能的差异,是造成各种微藻利用尿素能力差异的原因。孙灵毅等指出,微藻对尿素和铵盐的利用优于硝酸盐;张贵杰等认为培养牟氏角毛藻以尿素效果最好,硝酸钠次之,氯化铵较差;张青田等认为,以尿素为氮源较氯化铵更有利于隐藻的增殖。本实验显示,人尿添加量在2～10mL都能促进小环藻的生长。因此,小环藻能较好利用尿素。尿素中的氮因需经微生物或藻细胞的尿素酶分解而呈现迟效性肥水反应,使水质趋于稳定。此外,尿素不会引起藻类迅速繁殖,使水体出现短时间缺氧,有效延缓水质老化时间和富集有益微生物的作用,同时不会引起pH值大幅度变化。利用尿素等有机氮培养海洋微藻,可有效控制对虾养殖环境水质。3.4小环藻生长营养海泥抽出液对小环藻的生长影响最显著。虽然