三棱水煎液与芒硝配伍水煎液的谱图融合研究

三棱水煎液与芒硝配伍水煎液的谱图融合研究

“19岁担忧”歌曲的配方可以在明代刘春的经典内科小学找到。其指出了共19个相畏的药物,其中包括“牙硝难合京三棱”。京三棱又称荆三棱、草三棱、石三棱等,性味平、苦,无毒,主治症瘕鼓胀、痃癖、小儿气癖、乳汁不下等。牙硝,又称马牙硝,性味甘、大寒,无毒,能除五脏积热伏气。马牙硝是朴硝的一种,朴硝在盆中煎炼时,在上层,有牙状结构者,称为马牙硝。三棱中主要含有的化学成分有挥发油类、有机酸类、甾体类、黄酮类、苯丙素类等多类成分,而单波长的色谱指纹图谱无法对其进行整体表达和全面评价。因此本实验建立多个特征吸收波长下的色谱图,经筛选将254、300、320nm的色谱图进行融合以实现对二者配伍后物质基础变化的全面和整体评价。1仪器、试剂和试剂Agilent1100Series高效液相色谱仪(配有DAD、自动进样器);ChemStation工作站(Agilent科技有限公司);Shim-packCLC-ODS(150mm×6.0mm,5μm)色谱柱;HS6150型超声波清洗器(天津恒奥科技发展有限公司);CP225D电子分析天平(德国Sartorius,十万分之一)。甲醇(高效液相色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),水为去离子水。样品三棱、芒硝购自大连药房,经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定均为正品。本实验所用三棱为荆三棱生品。实验中用芒硝代替牙硝,虽然名称不同,但物质基础一样,不影响结果。2方法和结果2.1柱温2.2检测条件色谱柱:Shim-packCLC-ODS(150mm×6.0mm,5μm);流动相:A-水,B-甲醇(梯度洗脱程序:0~10min,2%B;10~15min,2%~30%B;15~25min,30%~33%B;25~35min,33%~40%B;35~70min,40%~50%B;70~95min,50%~55%B);流速:1.0mL/min;柱温:30℃;检测波长:254、300、320nm;进样量20μL。2.2试验溶液的制备2.2.1回收溶剂液氯基称取三棱药材粉末(过60目筛)20g,精密称定,置于圆底烧瓶中,加水200mL,回流提取3h,过滤,滤液加甲醇至50%(V/V),冷处避光放置、醇沉,过滤,滤液回收溶剂,用水定容至25mL,摇匀。精密吸取上述溶液5mL,置分液漏斗中,加入2倍量乙酸乙酯萃取2次,合并乙酸乙酯层,挥干溶剂,残留物用甲醇溶解,定容至5mL,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。2.2.2硝化反应提取分别称取三棱药材粉末(过60目筛)与芒硝各20g,精密称定,置圆底烧瓶中,加水400mL,回流提取3h。按“2.2.1”项下方法,制备合煎样品供试液。2.3最大峰面积覆盖融合图谱的确定精密吸取单煎液样品供试液20μL,连续进样6次,记录254、300、320nm波长下的色谱图,按照最大峰面积覆盖融合图谱,结果融合后图谱各峰相对保留时间与各峰相对峰面积的RSD均小于3.0%。表明检测系统的进样精密度良好。2.4最大峰面积覆盖融合图谱的测定取单煎液样品制备供试液5份,精密吸取供试液20μL进样测定,记录254、300、320nm波长下的色谱图,按照最大峰面积覆盖融合图谱,结果融合后图谱各峰相对保留时间与各峰相对峰面积的RSD均小于3.0%。表明方法的重复性良好。2.5方法的进样分析精密吸取单煎液样品供试液,在制备好样品供试液后的0、2、4、6、8h进样分析,记录254、300、320nm波长下的色谱图,按照最大峰面积覆盖融合图谱,结果融合后图谱各峰相对保留时间与各峰相对峰面积的RSD均小于3.0%。表明样品在8h内稳定。2.6含量测图谱的确定三棱水煎液与三棱芒硝合煎液进样量均为20μL,按照上述色谱条件,测得254、300、320nm波长处图谱,经相同保留时间色谱峰按最大峰面积覆盖融合生成三波长融合图谱,通过融合图谱比较单煎与合煎的物质基础变化。3综合插图方法3.1吸收波长的选取采用二极管阵列检测器进行全波长扫描,可知三棱药材样品在210~360nm区间范围内有吸收。其中254、300、320nm处所选目标峰分别有较大吸收,且这三个吸收波长下的吸收峰有一定的互补性。因此本实验选取254、300、320nm为检测波长。3.2谱图编码与编码选用三棱水煎液与三棱芒硝合煎液各三波长下的色谱图为研究对象,分别从ChemStation工作站中导出254、300、320nm谱图结果的dif格式的数据文件,将其转化为数据矩阵,再使用Matlab7.1进行编程,相同保留时间色谱峰按最大峰面积覆盖融合,使其成为一张能够同时反映3个波长的信息的色谱图。典型色谱图见图1、图2。3.3棱中互加硝系统的响应通过Matlab7.1进行融合后的图谱分析。对比图1与图2,制作表1。由表1数据可看出,16号峰变化不明显。17、18、19号峰峰面积都减少,18号峰变化最大,19号峰消失。可见,三棱中极性越小的物质,与芒硝作用越强,这与文献研究结果相似,可说明,三棱与芒硝合煎后,部分有效组分消失或者含量减少,不论是相对三棱还是相对芒硝的药理作用都降低。但1~15号峰峰面积都有不同程度的加大,究其原因,认为是在提取时,合煎的用水量大,芒硝为Na2SO4·10H2O,其中包含大量水分,提取溶剂量多,所以提取出的极性相对较大的成分含量多,具体机制有待进一步研究。4实验设计的局限性4.1“十九畏”是中医界沿袭数千年的用药禁忌,但大量的古今资料表明,“十九畏”在历史上是一个素有争议的问题。现代实验研究表明,“十九畏”药物有的并不相畏,有的是否相畏与配伍剂量以及病理、生理模型密切相关。笔者认为应在中医药理论指导下,以现代科学技术手段,从中药材物质基础及有效组分方面加强对“十九畏”药物之间配伍的的研究,以期对中药配伍和方剂运用的理论起到推动作用,促进临床合理用药,发展中医药理论。4.2中药的化学组成复杂性决定其不可能在单一的检测模式下反映其齐备性,而多波长指纹图谱模式的本质就是尽可能使谱图中每个指纹峰在其最大吸收波长(范围)状态下表达在图谱中。因此采用融合技术对不同波长的色谱图进行融合,互补不同类成分特征吸收差异性,在一张谱上全面地反映各类化学成分的含量差异,实现中药质量控制的较全面和较整体评价。4.3实验中考察了水-乙腈、水-甲醇为流动相时的色谱图,水-甲醇为系统流动相时分离度理想,特征峰明显,最终确定流动相为水-甲醇梯度洗脱。4.4本实验结果中,三棱芒硝合煎液中已经报道有药理作用的小极性成分明显减少,有些成分甚至