山核桃加工过程中主要脂肪酸的测定

山核桃加工过程中主要脂肪酸的测定

核桃是属于桃园科的一种植物。这是一种未经处理的天然深绿色。它也是许多干果中营养价值较高的物种之一1。山核桃仁中植物脂肪含量达70%以上,是名副其实的“果中油库”。而作为衡量植物油品质高低的重要指标———不饱和脂肪酸,在山核桃油脂中含量更高,达90%以上。研究表明山核桃油中的不饱和脂肪酸具有降低血脂,预防冠心病、动脉粥样硬化等作用,其中的亚油酸、亚麻酸更是人体必需的从体外摄入的脂肪酸［2］,因此经常食用坚果制品对人体有益［3－4］。由于山核桃中含有丰富的不饱和脂肪酸,在加工和贮藏过程中极易受温度、光照、氧气、水分、金属离子等因素的影响,发生氧化酸败,从而引起品质下降［5］。现有的关于油脂酸败的研究主要集中在核桃、瓜子、花生等干坚果上,以及极少数的对于贮藏过程山核桃、香榧油脂酸败的研究［6－7］。而对于加工过程中脂肪氧化的研究鲜有报道,仅有加工过程香榧油脂氧化和抗氧化活性的影响以及加工过程山核桃脂肪氧化的研究,结果认为在不同的加工阶段,脂肪酸氧化的程度不尽相同［8－9］。本试验以山核桃为材料,研究了传统加工工艺中4道主要加工工序对山核桃组成,主要脂肪酸含量变化,抗氧化能力及超微结构的影响,以期找到影响山核桃品质氧化的关键点,为提高山核桃的科学加工水平,防止加工过程氧化,更好地保持产品品质提供理论指导。1材料和方法1.1试验材料加工过程山核桃样品:临安创辉食品厂。油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸:美国sigma公司。1.2re-32aa旋转蒸发器GBC-Cintra20型紫外可见分光光度计:澳大利亚GBC公司;RE-52AA旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;JouanMR23i台式冷冻离心机:法国JOUAN公司;IKA-WERKE超微粉碎机:上海德东电机厂;SANYO低温冰箱:日本SANYO公司。1.3测试方法1.3.1纤维151058h原料→筛选分级(大小)→浮选(饱满度)→蒸煮(100~120℃,6~8h)→第1次炒制(高温开口)→浸料(调味)→第2次炒制(低温炒干)→制品。1.3.2脂肪酸组分分析油样的提取:样品去壳后,使用超微粉碎机将山核桃仁粉碎,料液比1∶20加入无水乙醚,搅拌1h,过夜浸提,过滤;滤液经旋转蒸发去除乙醚,得到油样,-20℃保存待用。用于脂肪酸组分分析和含量测定。提取液的制备:根据Mariod等［10］的方法略作修改,取5g山核桃仁,磨碎后加50mL95%的乙醇溶液,提取6h后过滤,收集滤液,滤渣再加50mL95%的乙醇溶液提取6h,过滤,合并滤液,备用。用于山核桃抗氧化能力的测定。1.3.3质谱条件与定性分析参照GB/T24304—2009测定。采用FinniganTraceGCUltraTraceDSQ单四级杆气相色谱/质谱仪(GC-MS),DB-23毛细管色谱柱(30m×0.25mmi.d.,0.25μm),进样口温度250℃,传输线温度220℃,柱温采用程序升温:初温50℃,保持1min后以25℃/min速度升至175℃,再以4℃/min速度升至211℃,保持1min。载气为高纯氦气(99.999%)。采用分流进样,分流比20∶1,进样量2μL,离子源EI,电子能量70eV,加速电压3kV,分辨率500amu/s,离子源温度250℃,溶剂延迟2min。定性分析:采集到的质谱图用NIST检索;定量分析:根据总离子流图色谱峰的峰面积归一化法计算各组分的相对含量。1.3.5fid检测条件根据ue6c0zcan等［11］的方法,略作修改。采用Agi-lent7890A气相色谱仪,分流进样,分流比20∶1,进样量2μL,进样口温度250℃,DB-23毛细管色谱柱(30m×0.25mmi.d.,0.25μm),FID检测器,检测器温度220℃。采用程序升温:初温50℃,保持1min后以25℃/min速度升至175℃,再以4℃/min速度升至211℃,保持1min。载气为高纯氮气(99.999%)。柱头压力230kPa恒压(在50℃,33cm/s),检测器气体氢气40mL/min,空气450mL/min,氮做尾吹气30mL/min,溶剂延迟2min。定性分析:相同条件下用标准品进样,比对保留时间;定量分析:将标准品制备成一个浓度梯度,制作标准品的标准曲线,然后将样品测得的峰面积在标准曲线上找到对应的浓度。1.3.6清除邻苯三酚参照张晓璐等［12］的邻苯三酚自氧化法。25℃下,在10mL容量瓶中依次加入0.05mmol/LTris-HCL溶液5.0mL(pH8.3),不同浓度的样品液0.5mL,蒸馏水3.3mL,2mmol/L邻苯三酚0.2mL,总体积9mL。以双蒸水作对照,迅速混匀后,测定2min内吸光度A322的变化,求斜率V。清除率=(V空-V样)/V空×100%式中:V空为蒸馏水代替样品液测得的对照的斜率;V样为样品液测得的斜率。1.3.7样品溶液的制备参照宋丽丽等［7］的方法,并略做修改。配置5%亚油酸乙醇溶液做底物溶液,加入10%的样品液,混匀后置于培养箱中于(40±1)℃下培养,48h后,取1mL待测样品,加入1mL25%的三氯乙酸,混匀放置,终止反应。532nm下比色测定提取液的吸光度A值,同时测定不加提取液的空白样品的吸光度A值。1.3.8dpph清除能力测定参照Larrauri等［13］的方法,略有修改。取山核桃仁10g,磨碎,加入100mL95%乙醇充分浸提6h,重复2次,收集虑液。取1mL提取液,加入3mL1×10－4mol/L的DPPH·溶液(95%乙醇配制),在25℃下静置30min,测定517nm处的吸光值。DP-PH·自由基清除能力计算公式:样品对DPPH清除能力=1-[(A-B)/A0]×100%,其中A0为未加样品的DPPH·(3mLDPPH·+1mL甲醇)的吸光值;A为样品与DPPH·反应后的吸光值;B为空白样品(1mL样品液+3mL甲醇)的吸光值。1.3.9关于山核的细胞结构的观察委托浙江大学生物所电镜室测定。1.4数据的统计分析以上指标均重复测定3次取平均值,应用SPSS16.0软件进行数据统计和差异显著性分析。2结果与分析2.1山核桃脂肪酸甲酯的初步确定采用气相色谱-质谱对山核桃原料脂肪酸成分进行检测分析。经比对,确认山核桃脂肪酸13种,分别为油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、棕榈酸(C16∶0)、亚麻酸(C18∶3)、硬脂酸(C18∶0)、花生一烯酸(C20∶1)、棕榈油酸(C16∶1)、花生酸(C20∶0)、十七碳烯酸(C17∶1)、十七烷酸(C17∶0)、十四烷酸(C14∶0)、山俞酸(C22∶0)、十五烷酸(C15∶0)(表1)。其中油酸、亚油酸、棕榈酸、亚麻酸峰的质量分数明显大于其他脂肪酸,占总脂肪酸的95%左右。由此可初步确定油酸、亚油酸、棕榈酸、亚麻酸为山核桃中最主要的4种脂肪酸;其中油酸、亚油酸、亚麻酸为不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的91.52%。采用气相色谱方法,获得4个脂肪酸甲酯的标准曲线。分别为:油酸甲酯Area=705.002037Amt+0,相关系数0.99996亚油酸甲酯Area=752.990911Amt+0,相关系数0.99941亚麻酸甲酯Area=738.166311Amt+0,相关系数0.99996棕榈酸甲酯Area=1104.52548Amt+0,相关系数0.999852.2蒸煮工序对山核桃脂肪酸酸败的影响气相色谱法测定山核桃主要脂肪酸棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸在加工过程中的含量变化。结果发现,4种脂肪酸含量均呈缓慢下降的趋势。其中,棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸在蒸煮过程都有一个较大幅度的下降,分别较前一工序下降了0.73%、0.80%、5.95%和8.09%,说明蒸煮工序是影响山核桃脂肪酸酸败的主要工序,这可能是由于长时间高温加速了脂肪酸的水解、氧化(图1)。棕榈酸和油酸在第1次炒制工序也有一个明显的下降,可能是由于高温炒制及山核桃开口后与氧气直接接触,导致脂肪酸的加速劣变,两者在整个加工过程中分别下降12.28%和17.36%(图1c和图1d)。2.3山核桃dpph自由基清除能力由图2a可见,加工过程中山核桃超氧阴离子清除能力呈下降趋势,蒸煮工序对其影响最大,其次是第1次炒制,分别较前一工序下降了36.05%和17.46%。加工过程中山核桃亚油酸脂质过氧化程度逐渐上升,其中蒸煮和浸料工序加速了脂质过氧化的发生,TBA值分别较前一工序上升了6.44%和7.14%(见图2b)。DPPH是一种稳定的有机自由基,通过检测植物组织对DPPH·自由基清除能力可评价其抗氧化能力的强弱［7］。由图2c知,在整个加工过程中,山核桃DPPH自由基的清除能力始终处于一个缓慢下降的状态。蒸煮、第1次炒制和浸料工序对其影响明显大于第2次炒制工序,但从总体水平上看,加工过程山核桃的DPPH自由基清除能力变化不显著。2.4细胞内脂滴分布从电镜观察结果可以看到山核桃原料细胞饱满,细胞内脂滴明显,均匀散状分布,脂滴间分隔清楚(图3a)。经蒸煮后,细胞内已观察不到完整脂滴,即已完全破裂,脂滴内油脂被释放至细胞质中(图3b)。之后,随着加工过程的继续,油脂进一步扩散融合。3山核桃油酸氧化速率的变化已有研究表明,蒸煮与浸泡工序能显著加剧山核桃酸价,过氧化值的上升［8］。本试验中,蒸煮也是影响山核桃4种主要脂肪酸含量下降的最主要工序,其中棕榈酸和油酸在第1次炒制工序有一个明显的下降,说明高温是影响山核桃脂肪酸氧化的一个重要因素,这与Mexis等［14］在核桃上的研究结果一致。坚果氧化的程度除了受成熟度、加工方法等的影响外,起主导作用的因素还是自身脂肪酸组成［15］。其中富含亚油酸和亚麻酸的山核桃油脂极易发生氧化。Zhou等［16］研究表明,在常温下,油酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯的氧化速率之比为1∶12.5∶25。本试验中,从原料到制品,4种主要脂肪酸棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸分别下降了4.22%、2.86%、12.28%和17.36%,以油酸氧化速率为1,则油酸、亚油酸和亚麻酸相对氧化速率为1∶4.29∶6.07,即随着双键数量的增加氧化速率加快。其中,油酸的氧化速率略低于棕榈酸1∶1.48,其原因可能是长时间高温导致了饱和脂肪酸棕榈酸的氧化,而油酸因绝对含量很高,导致其相对含量的降低表现较小,具体原因需进一步研究证实。采用透射电镜观察加工过程山核桃细胞脂滴结构变化,可以看到经蒸煮后细胞内脂滴完全破裂,油脂散布整个胞内空间,这说明在加工一开始,山核桃细胞结构即发生破坏,氧化进一步加剧。水煮和蒸煮处理会损失山核桃自身还原性物质,使得还原力下降［17］。Xu等［18］发现浸泡、水煮和蒸煮会导致冷季豆类的抗氧化能力降低,总酚含量变小。Zhang等［19］也发现热处理会导致苦荞麦粉抗氧化能力下降。本试验测定山核桃加工过程抗氧化能力变化,结果表明蒸煮与浸料工序能明显加剧山核桃亚油酸脂质过氧化程度,同时蒸煮还大幅降低了山核桃超氧阴离子清除能力。因此认为蒸煮是山核桃传统加工工艺中的关键工序,浸料对山核桃抗氧化能力的降低也有重要影响。试验表明,要抑制山核桃脂质过氧化,同时维持