成熟液添加egf和-基乙醇对绵羔羊卵母细胞的影响

成熟液添加egf和-基乙醇对绵羔羊卵母细胞的影响

juveniemi传记transzer，juveniet）是一个集幼牛超声卵、卵母细胞外成熟、体外受精、卵外培养和胚胎移植技术于一体的先进生物技术体系。利用幼畜体外胚胎生产技术能够获得大量卵母细胞,充分利用优良母畜的遗传资源,缩短世代间隔,加快育种进程。然而,幼畜卵母细胞核成熟和质成熟不充分,卵母细胞异常受精率高于成年动物。这些问题造成幼畜卵母细胞体外囊胚率低,胚胎移植后代出生率低。目前,幼畜体外胚胎生产大多采用成年动物的体外胚胎生产体系,导致幼畜体外胚胎生产效率普遍较低。因此,需要进一步研究幼畜卵母细胞体外成熟、体外受精和体外发育,不断完善幼畜胚胎体外生产体系,提高幼畜卵母细胞生产体外胚胎的效率。为优化绵羔羊卵母细胞体外成熟条件,笔者比较了不同浓度的表皮生长因子(EGF)和β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)对绵羔羊卵母细胞受精情况、卵裂率和囊胚率的影响,并与成年羊卵母细胞进行了比较。1材料和方法1.1材料表面1.1.1成年羊卵粒采集挑选生长发育良好的4～8周龄母绵羔羊进行超数排卵,手术后注射器活体采卵;成年羊卵巢采自新疆石河子市牛羊定点屠宰场。冷冻精液为实验室自制的绵羊颗粒冻精。1.1.2药品、试剂和仪器M199(Gibco-31100-03)、FSH(Vetrepharm,Canada,1-800-032-355)、LH和PMSG(宁波市三生药业)、四孔板(NUNC,109199)和培养皿(NUNC,113973)。试剂除特别指明外,均SIGMA公司药品。发情羊血清(ESS)为实验室自制。从发情1.5d的母羊颈静脉采集血液,室温下静置12h左右,取上清液,56℃水浴灭活30min,用0.22μl滤器过滤后分装,-20℃冷冻保存。1.2卵母细胞的收集参照Kelly等的方法进行羔羊激素处理。将处理后的羔羊打开腹腔,将卵巢引到腹腔外,用含有2ml吸卵液(M199原液+25mmol/LHEPES+0.2%BSA+100mg/LHeparin)的20G针头一次性注射器活体吸取卵泡中的卵母细胞。在体式显微镜收集A、B级卵子。统计卵母细胞数量。成年羊卵巢从屠宰场采集后,用同样规格注射器活体采卵。1.3成熟液浓度的确定将收集卵母细胞在成熟液(空白组:M199原液+10%ESS+10μg/mlFSH+10μg/mlLH+1μg/mlE2)中洗1～2遍后分别移入在培养箱中平衡2h的50μl成熟液微滴中,每滴10～20枚卵母细胞,38.5℃、5%CO2饱和湿度培养24h。成熟液成分:成熟液Ⅰ为空白组中分别加入10、50、100ng/ml的EGF;成熟液Ⅱ为空白组中分别加入50、100、200μmol/L的β巯基乙醇;成熟液Ⅲ为空白组中加入最优浓度的EGF和β巯基乙醇。1.4u3000naclamine+0.1motaurin+10g/mlas-5.3.4和10.违规元素l.4e的滴中卵母细胞成熟培养24h后,轻轻吹打除去部分颗粒细胞,移入平衡2h的40μl受精液(SOF+0.2μmol/LPenicillamine+0.1μmol/LHypotaurine+10μg/mlHeparin+10%ESS)滴中,每滴20枚。冷冻颗粒精液在39℃水浴中解冻后采用Percoll梯度(45%和90%)离心法收集活力较好的精子,稀释成5×106/ml。将10μl精子稀释液移入受精液滴中。置于38.5℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中受精18h。1.5体外培养体外培养轻轻吹打受精的卵母细胞除去颗粒细胞和周围精子,在胚胎发育液(SOF+2%BME(EAA)+1%MEM(NEAA)+0.1mmol/LGlutamine+0.5mg/mlMys-Inositol+0.8%BSA)中清洗1～2次后,以15～20枚/50μl的密度移入已经平衡2h的发育液滴中,在饱和湿度的培养箱中,38.5℃、5%CO2进行体外培养。从受精开始计时,48h统计卵裂率,第6～8天统计囊胚率。1.6正常生殖中未红色凝胶原核的检测将体外受精18h后的卵母细胞在透明质酸酶轻轻吹打,除去表面的颗粒细胞。移到四孔板内固定液(无水乙醇∶冰醋酸,3∶1,4℃)中固定24h后,载玻片上预覆盖盖玻片四角的位置涂上石蜡凡士林混合物。将卵母细胞和少量固定液一起移到载玻片上,然后用盖玻片轻轻压片固定住卵母细胞,使用1%地衣红染色9min,脱色液(纯水∶醋酸∶甘油=3∶1∶1)脱去染色液,然后置于相差显微镜下观察细胞核状态。双原核为正常受精卵;单原核或无原核为未受精卵;多原核(n≥3)为多精入卵,如图1所示。1.7数据处理和分析用卡方检验χ2进行差异显著性分析。2结果与分析2.1组患儿各局部点囊胚率的比较由表1可知,空白组羔羊卵母细胞卵裂率为63.7%,各浓度EGF组羔羊卵母细胞卵裂率分别为66.4%、65.5%和64.3%,4组之间差异不显著(P>0.05),但均显著低于成年羊组(77.3%,P<0.05)。空白组囊胚率为10.5%,低于各浓度EGF组囊胚率(12.0%、12.8%和12.7%),但差异不显著(P>0.05);空白组和各浓度EGF组囊胚率显著低于成年羊组(30.5%,P<0.05)。2.2各浓度-基乙醇对大鼠囊胚率的影响由表2可知,空白组羔羊卵母细胞卵裂率(64.2%)和各浓度β-巯基乙醇组羔羊卵母细胞卵裂率(65.6%、68.2%和67.8%)差异不显著(P>0.05),但仍显著低于成年羊组(77.3%,P<0.05);空白组囊胚率(9.8%)显著低于100μmol/Lβ-巯基乙醇组(19.3%,P<0.05),与其他浓度β-巯基乙醇组差异不显著(P>0.05);各浓度β-巯基乙醇组囊胚率差异不显著(P>0.05);空白组和各浓度β-巯基乙醇组均显著低于成年羊组(31.0%,P<0.05)。2.3两组不同时点分布比较,见表1由表3可知,成年羊组和β-巯基乙醇组的正常受精率分别为79.7%和74.5%,差异不显著(P>0.05),但显著高于空白组(62.2%,P<0.05)。空白组多精入卵率(17.8%)显著高于成年羊组(8.0%,P<0.05),成年羊组和β-巯基乙醇组(12.0%)之间差异不显著(P>0.05)。空白组未受精率(20.0%)高于成年羊组(12.3%)和β-巯基乙醇组(13.5%),但差异不显著(P>0.05)。3成熟液中添加ndf对牛卵母细胞的影响3.1成熟液中添加EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的多肽物质,EGF与细胞表面的EGF受体(EGFR)结合,引起EGFR二聚体形成、酪氨酸激酶迅速激活以及酪氨酸自动磷酸化,并导致信号传导途径中作为第二信使的特异性基质蛋白磷酸化,由此调节有丝分裂以及其他细胞活动。EGF存在于机体多种组织中,在卵巢上卵泡和基质中均有表达。研究表明,EGF受体存在于未成熟卵丘-卵母细胞复合体(COCs),EGF能促进卵母细胞减数分裂。EGF能诱导卵母细胞的成熟,在无血清的成熟培养液中培养小鼠、牛、猪和人卵母细胞均能促进卵母细胞核和细胞质成熟。Lonergan等研究表明,在无血清的成熟培养基中培养牛卵母细胞,添加EGF能显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率,且对裸卵的成熟也有促进作用,但在含血清的成熟培养液中则不会有所提高。EGF能诱导颗粒细胞扩散,促进卵母细胞成熟。Park等研究表明,在无血清成熟培养液中培养,能提高牛卵母细胞受精率和囊胚率,但不能提高囊胚细胞数。该研究中成熟液中加入不同浓度EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均无明显影响,这与上述报道的结果有所不同。这可能是因为成熟液中加入了发情羊血清(ESS),而ESS里可能含有EGF或某些能替代EGF的物质,这需要对ESS具体成分做进一步研究。幼畜卵母细胞发育能力显著低于成年动物。目前普遍认为幼畜卵母细胞发育能力低是由于细胞质发育不成熟所致,也有报道认为是细胞核不成熟所致。该研究中羔羊卵母细胞发育能力仍显著低于成年羊,这需要进一步对幼畜卵母细胞核质发育机制进行研究。3.2成熟液中添加β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞受精情况、卵裂率和囊胚率的影响活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS),如超氧负离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)等,是细胞内代谢过程中产生的一类含氧产物。研究表明,低浓度ROS能促进配子的相互作用。但更多的试验表明ROS在体外胚胎生产中是不利的。ROS的这些不利影响包括:降低精子的活力、导致染色体蛋白的氧化磷酸化、阻滞卵裂并造成胚胎的发育能力的下降等。与体内胚胎发育相比,体外胚胎培养会导致ROS含量升高。ROS能透过细胞膜并造成细胞内脂质、蛋白和核酸等分子的结构改变,这些将会影响胚胎早期的发育。在体内,细胞通过ROS清除剂(抗氧化剂)中和ROS的不利影响。然而,由于没有体内抗氧化剂的保护,体外培养卵母细胞和胚胎时抗氧化剂的含量低于体内。因此,需要向培养基中加入抗氧化剂或抗氧化剂前体,这将对体外卵母成熟和胚胎发育起到非常重要的作用。谷胱甘肽(GSH)在哺乳动物细胞抗氧化损伤方面具有重要作用。在成年动物卵母细胞中,GSH含量的增加发生在卵母细胞排卵前,而幼畜卵母细胞合成GSH的能力又显著低于成年动物。受精后,GSH参与卵母细胞的激活和精子的解聚以及受精精子头转化为雄原核。因此,成熟液中添加含巯基化合物(GSH前体物质,如胱氨酸、半胱氨酸、半胱胺和β-巯基乙醇等)能够提高细胞质中GSH的浓度,保护卵母细胞以及精子免受ROS的氧化损伤,提高卵母细胞的成熟率和胚胎的发育能力。该研究中向成熟液中添加100μmol/Lβ-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞正常受精比例,多精入卵比例也明显下降,且正常受精的比例与成年羊没有显著差异。这说明卵母细胞中合成的GSH在一