注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质的分离

注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质的分离

苯磺顺-阿丘铵的主要成分为苯磺顺-阿丘铵，其化学名字为（1r、1r、2r、2r）-2、2'二氧代-4和10-二氧基丙烯酸酯的二苯磺酸盐）。2-（1,2,3,4-四羟基-6，7-二氧基-1-异丙醇）二苯磺酸盐。阿曲库铵有4个手性原子,并且分子结构对称,因此有10种立体异构体。顺式阿曲库铵(cisatracurium,图1)是阿曲库铵的顺式异构体,它与阿曲库铵具有相似的肌松效应和代谢方式,其效能强于阿曲库铵,是近年来临床麻醉中最常用的中时效非去极化肌松药之一。美国药典(USP32-NF27)、英国药典(BP2010)和欧洲药典(EP7.0)均收录了苯磺酸阿曲库铵,规定采用含有非挥发性缓冲盐的流动相梯度洗脱对其有关物质进行检查,并提供了可能存在的部分有关物质的化学结构式及名称;但是,苯磺顺阿曲库铵未见收载。《中华人民共和国药典:二部》(2010年版)收载了苯磺顺阿曲库铵及注射用苯磺顺阿曲库铵,对有关物质总量和部分单个有关物质含量限度进行控制,但是缺乏杂质对照品和典型色谱行为参照。根据人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)要求,对药物中含量大于0.1%的杂质要进行定性研究。因此,研究注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质,并进行结构分析或归属,对保障其临床使用的安全性和有效性十分必要。1材料表面1.1合成腈、甲醇注射用苯磺顺阿曲库铵[批号:20110501-1,东英(江苏)药业有限公司];乙腈、甲醇(色谱纯,美国Merck公司);其余试剂均为市售分析纯。1.2数据处理系统Chromaster5430高效液相色谱仪(日本日立公司);1260Infinity液相色谱-6224飞行时间质谱仪,MassHunterQualitativeAnalysisB.04.00数据处理系统(美国Agilent公司);TSQQuantumUltraAM型LC-MS/MS联用仪,Xcalibur1.2数据处理系统(美国ThermoFinnigan公司);Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。2方法2.1质量分析的质量分析条件2.1.1流动液相色谱2-乙腈-甲醇-甲酸SEPAXGP-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,水-乙腈-甲醇-甲酸(650∶175∶175∶10,1.010L中含甲酸铵1.3g)流动相等度洗脱;柱温:35℃;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;检测波长:280nm。2.1.2ms/ms测定破乳工艺m/z98采用电喷雾离子化方法正离子检测。TOF-MS测定的喷雾电压4kV,雾化气压力2.76×105Pa,流量10L/min,温度350℃,碎片电压200V,参比离子m/z121.0508和922.0098,质量扫描范围m/z100～1200。MS/MS测定的喷雾电压5kV,雾化气压力3.10×105Pa,辅助气压力1.38×105Pa,毛细管温度350℃,二级质谱碰撞气氩气压力0.17Pa,碰撞能量25eV。柱后分流,0.2mL/min进入质谱检测,同时用0.2mL/min乙腈ESI鞘液辅助质谱离子化。2.2试验溶液的制备取注射用苯磺顺阿曲库铵适量,加流动相溶解并稀释成质量浓度约为0.5mg/mL的溶液,滤过,取续滤液作为供试品溶液。3结果和讨论3.1质谱条件的确定将供试品溶液按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱与质谱条件,利用LC/TOF-MS和LC-MS/MS分别采用全扫描质谱和子离子二级质谱对样品进行检测。获得注射用苯磺顺阿曲库铵的DAD图(图略)、总离子流图(图2)及二级质谱图。根据HPLC-UV测得各有关物质保留时间从小到大顺次编号,显示11个主要有关物质峰,其中7个(峰1、2、4、6、8、10和11)的含量大于0.1%。3.2物质的组成式鉴定根据本品结构特征,对LC/ESI-TOF-MS测得各有关物质正离子的准确质量,通过MassHunter软件进行有关物质的实验式鉴定(设置C、H、O、N组成限度分别为60、120、30和5,质量偏差限度为3)。结果(表1)表明,注射用苯磺顺阿曲库铵中的主要有关物质为其中间体、结构单元以及它们的同分异构体。3.3芦基异喹啉母核结构的鉴定注射用苯磺顺阿曲库铵及其部分有关物质结构中均含季铵离子基团,电喷雾离子化时可形成[M]2+或[M]+离子;另有部分有关物质结构中含有叔胺基团,则在电喷雾离子化时可形成[M+H]2+或[M+H]+离子。根据所测得各有关物质的母离子及其二级质谱碎片离子进行解析,并参照欧洲药典(第7版)关于苯磺酸阿曲库铵的系统适用性试验及可能的有关物质结构,可对本品中各有关物质的结构进行初步鉴定。顺阿曲库铵与有关物质峰8:ESI-MS测得顺阿曲库铵C53H72N2O122+母离子[M]2+的m/z为464,其二级质谱中主要产生的碎片离子为m/z370、358、327、307、244、189、165和151(图3)。顺阿曲库铵[M]2+离子的二级质谱裂解途径见图4。母离子中的1个四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解分别形成含有2个季铵基团的双电荷碎片离子m/z307和含有1个季铵基团的单电荷碎片离子m/z244。母离子中四氢吡啶环的开环裂解还形成不含氮原子的特征碎片离子m/z327,进一步断裂形成m/z189、165的特征单电荷碎片离子。结构中与四氢异喹啉N相连支链的价键断裂,则形成m/z分别为370和358的具有藜芦基异喹啉母核结构单元特征的单电荷含氮碎片离子。m/z358进一步断裂形成m/z151的特征单电荷碎片离子。有关物质峰8具有与顺阿曲库铵峰完全相同的母离子和二级碎片离子(图4)。参考欧洲药典(第7版)苯磺酸阿曲库铵标准中所列出的可能有关物质结构,确证其为阿曲库铵的顺-反异构体。有关物质峰1:LC/TOF-MS确定其离子组成为C24H32NO6+,碎片离子m/z370、327、189、165和151与顺阿曲库铵二级质谱中的特征碎片离子相同,说明也具有藜芦基异喹啉的母核,推测其可能为顺阿曲库铵结构中酯键断裂形成的单季铵离子产物,m/z116为其特征碎片离子,为结构中四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成(图5)。并参考欧洲药典,确证有关物质峰1为3-[1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉]丙酸盐。有关物质峰2:LC/TOF-MS确定其离子组成为C21H28NO4+,比顺阿曲库铵的相对分子质量少572,推断由顺阿曲库铵主要结构单元脱落形成。m/z206为其特征碎片离子,为结构中四氢异喹啉环上与碳相连的取代基断裂形成(图6)。并参考欧洲药典,确证有关物质峰2为1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉。有关物质峰3和4:LC/TOF-MS确定两者离子组成均为C25H34NO6+,比有关物质峰1的相对分子质量多14。两者碎片离子相同,推测有关物质峰3和4在结构上为有关物质峰1的甲酯化物。m/z130为其特征碎片离子,为结构中四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成(图7)。综上,有关物质峰3和4为3-[1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉]甲基丙酸酯的一对顺反异构体,在已有药典标准中未明确规定。根据欧洲药典苯磺酸阿曲库铵有关物质检查项下各有关物质相对保留时间的先后顺序,顺式化合物较其反式结构有更强的色谱保留。故推断有关物质峰3为反式异构体,有关物质峰4为顺式异构体。有关物质峰5和6:LC/TOF-MS确定两者离子组成均为C29H42NO7+,比顺阿曲库铵的相对分子质量少413,推测其为顺阿曲库铵结构中保留1个酯键,而另一酯键断裂形成的羟基化合物。两者碎片离子相似,特征碎片离子m/z202为结构中四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成。m/z412为结构中酯键断裂并与二甲氧基苄基环合形成(图8)。推测有关物质峰5和6为1-(3,4-二甲氧基苄基)-2-[3-[(5-羟戊基)氧]3-氧丙基]-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉的一对顺反异构体,按前述色谱保留规律,推断有关物质峰5为反式异构体,有关物质峰6为顺式异构体。有关物质峰7:LC/TOF-MS确定其离子组成为C53H72N2O132+,比顺阿曲库铵的相对分子质量多16,推测其为顺阿曲库铵结构中苯环羟基化的产物,在已有药典标准中未明确规定,酚羟基的具体取代位置有待进一步确定。特征碎片离子m/z343为母离子中含酚羟基的1个四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成,m/z315为结构中含酚羟基的四氢吡啶环开环断裂形成,其裂解途径见图9。有关物质峰9:LC/TOF-MS确定其离子组成为C53H70N2O132+,比顺阿曲库铵的相对分子质量多14,推测其为顺阿曲库铵结构中苯环羟基化且四氢异喹啉环脱氢的产物,在已有药典标准中未明确规定,酚羟基的具体取代位置有待进一步确定。特征碎片离子m/z341和313分别为结构中含酚羟基和结构中不含酚羟基的四氢吡啶环开环断裂形成,其裂解途径见图10。有关物质峰10:LC/TOF-MS确定其离子组成为C52H68N2O122+,比顺阿曲库铵的相对分子质量少16,推测其为顺阿曲库铵结构中脱CH2和H2形成。特征碎片离子m/z299为结构中四氢异喹啉环开环断裂形成,m/z342为结构中二氢异喹啉N相连支链的价键断裂形成,其裂解途径见图11。推测有关物质峰10为1-(3,4-二甲氧基苄基)-2-{3-{5-{3-[1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-烷基]丙酰氧基}戊氧基}-3-氧丙基}-6,7-二甲氧基-1,2-二氢异喹啉,在已有药典标准中未明确规定。有关物质峰11:LC/TOF-MS确定其离子组成为C32H44NO8+,比顺阿曲库铵的相对分子质量少359,碎片离子m/z370、327、256、189均与顺阿曲库铵二级质谱中的特征碎片离子相同,推测其为顺阿曲库铵分子中一个四氢异喹啉N相连支链的价键断裂形成,其裂解途径见图12。并参考欧洲药典,确证有关物质峰11为1-(3,4-二甲氧基苄基)-2-(3,11-二氧代-4,10-二氧十三烷-12-烯烃)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3