蛋白质印迹分析课件

蛋白质印迹分析Westernblotting实验一实验时间安排第一天第二天第三天1.SDS胶制备；2.样品制备和样品蛋白质含量测定；3.电泳；1.转移电泳2.考马斯亮蓝染色3.膜封闭4.加1抗过夜温浴1.洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色2.加酶标2抗温浴3.洗膜与显示4.结果分析Westernblotting

蛋白质印迹一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。

第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。

第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，常用NC膜和PVDF膜。

第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。实验原理第一部分：SDS十二烷基磺酸钠电泳1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同蛋白将带不同量的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极推进。

β-巯基乙醇为还原剂，破坏二硫键。2.蛋白样品处于pH6.8压缩胶的上层，pH8.8的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶运动中，Pro-受阻小，不同的蛋白质可被浓缩到分离胶的上成层，使全部蛋白质处于同一起跑线上；当蛋白质进入分离胶时，不同蛋白因分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围丙烯酰胺浓度（％）

线性分离范围（KD）

1510~431212~601020~807.536~945.057~212第二部分：样品的印迹1.选择适当的膜并进行预处理：NC膜的预处理：剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上PVDF膜的预处理：剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2分钟。转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2；硝酸纤维素膜：80µg/cm2）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间（h）

801408%1.52.0258010%1.5154012%0.75﹤2015%0.52.电流1mA-2mA/cm2，通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。第三部分：特异抗体与抗原结合、显色样品转移到硝酸纤维素膜的过程称为印迹（blot）。膜封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。

提取组织或细胞蛋白，测得含量制备SDS胶蛋白样品变性、电泳电泳转膜封闭，一抗过夜清洗，二抗结合清洗，底物显色，曝光、显影，结果分析基本操作流程实验操作一、小鼠血清制备（PreparationofMouseSerum）（已准备好）

取小鼠一只，断颈收集血液于一只1.5ml离心管中，置37℃温浴15-45min；其间，用剪刀开腹取出肝脏100mg左右，或者剪取鼠尾巴约1cm长，置-20℃保存（实验四使用）盐析制备球蛋白：向小鼠血清中加入等体积饱和硫酸铵溶液，充分混匀后室温放置5min，10000转/min离心，5min，弃上清，加入与血清等体积0.15mol/LNaCl。溶解后即得小鼠IgG样品。对照兔血清样品同法制备。二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.胶模准备与灌胶：配分离胶（10ml）：取一个烧杯，加入以下成分:

分离胶缓冲液2.5ml40%丙烯酰胺胶液2.5mlH2O4.9ml10%过硫酸铵0.1ml充分混匀后，再加入5μlTEMED，立即摇匀，灌入胶模，至距胶顶约1.5cm；徐徐加入0.5-1ml水覆盖胶顶。室温放置待胶凝聚（约需30分钟），其间配压缩胶。

配压缩胶（4ml）：取一个烧杯，加入以下成分:

压缩胶缓冲液1.0ml40%丙烯酰胺胶液0.5mlH2O2.5ml10%过硫酸铵40μl混匀；待分离胶与上面的水层之间的界限由清晰逐渐消失，又重新出现后，倾去上层水，用滤纸吸干；向压缩胶混合液中加入4μlTEMED，立即摇匀，灌入胶模至距胶顶约0.5cm；徐徐插入上样梳，勿留仍何气泡于胶液中；放置1小时以上。2.Bradford法蛋白质含量测定：

取8只试管，按以下顺序加入各种试剂：

管号:12345鼠IgG兔IgG空白

标准蛋白μL样品μl0.15MNaClμL102030405011290280270260250299299300向每只管中各加入显色试剂3mL，立即混匀，放置10min后，于分光光度计上，595nm比色测定OD值；以OD值为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，作图求出血清中蛋白质的浓度。3.样品准备：

分别取含适量的小鼠血清的及兔血清（阴性对照）置入1.5ml离心管中，根据样品体积，分别加2×SDS电泳上样液至250μL，混匀；置95℃加热10min。样品（250μL）5μg/μL2×SDS

（125μL）血清

（XμL）=

5μg/μL×250μL÷血清蛋白浓度0.9%NaCl

（125-XμL）4.装配：

胶凝后，去除夹子和垫条；将电泳仪的下槽中注满电极液，将胶模的有耳短玻板面向电泳仪的支架，插入电泳仪下槽；用大夹子将胶模上部与支架夹紧；向电泳仪上槽中加入电极液，至没过短玻板上缘1cm；观察上槽液有无泄漏。无泄漏时，用记号笔标记上样井位置，拔除上样梳，整理上样井。5.上样：

向上样井中顺序加入相当量的样品，鼠IgG100μg、10μg；兔IgG100μg、10μg；蛋白分子量标准物10μl；鼠血清100μg、10μg；兔IgG100μg、10μg；预染色的蛋白分子量标准物10μl。一份用于蛋白印迹分析，一份用于染色分析。鼠100μg鼠10μg兔100μg兔10μgM(预染）鼠100μg鼠10μg兔100μg兔10μgM(未预染）印迹分析染色分析6.电泳：

将电泳电源与电泳仪用导线相连，负极接上槽，正极接下槽；加电压（25V/大胶；10V/小胶）过夜电泳。三、转移电泳

TransferElectrophoresis盛有电转移缓冲液的塑料盘中，按顺序浸入垫网，二张滤纸(与垫网同大)，剪一与分离胶同大的硝酸纤维素膜，先让其漂在液面上，待液体浸透膜，无任何白斑后，让液体没过膜，再浸入二层滤纸和一层垫网。

1.电转移准备：2.转移夹装配：

向转移电泳仪中注入转移电泳缓冲液至三分之一高度；

盛有转移电泳缓冲液的塑料盘中，将转移夹板打开，夹板的一扇板平置入塑料盘中，另一扇板直立；然后按顺序逐层移入一层垫网和两层滤纸，层间不可留有气泡；

电泳完毕，取下电泳胶模，将有耳玻板面向下平置桌面上，向下端两玻板间插入刀片将玻板分开；；用刀片切去压缩胶，再将分离胶从中分为两半，一半用于电转移一半用于考马斯亮蓝染色（参见附1）；将胶平放在滤纸的中央，其与滤纸之间不可留气泡；再顺序逐层覆盖上硝酸纤维素膜，二层滤纸和垫网；扣上转移夹，将其夹扣位于上方插入转移电泳槽中，注意令硝酸纤维素膜所在一侧对向红色接线柱，绝不可颠倒。NC膜滤纸滤纸SDS滤纸滤纸＋－SDSNC膜3.转移电泳：

向转移电泳仪中注入转移电泳缓冲液，液面必须没过硝酸纤维素膜顶端；转移电泳仪中放入一磁搅棒，合上盖子，将转移电泳仪置于一磁力搅拌器上；用导线将转移电泳电源与转移电泳仪连接，正极接红色接线柱，负极接黑色接线柱；开启磁力搅拌器；调转动速度，以磁力搅拌子转动不会被甩开，而速度又最大为度；设输出电压为50伏，通电电泳2小时，最好在4℃进行。四、酶标免疫反应显示

Immuno-detectionofProteinBlotswithHRP-labeledAntibody1.蛋白转移膜的丽春红染色显示（本次实验不做此步）

转移电泳完毕，断电，取出转移夹，取出转印膜于20ml蒸馏水中漂洗一遍，然后用10ml丽春红染液（0.2%丽春红-1%乙酸）染1min；用蒸馏水漂洗至背景近白色，漂洗应少量多次，每次30ml左右；照相留底；继续用蒸馏水漂洗至色带消失或者基本消失。

2.免疫反应：

将硝酸纤维素膜，在含蛋白质面用圆珠笔作方位标记和蛋白质分子量标准物位置标记；然后浸入漂洗缓冲液中漂洗2分钟,去除漂洗液；加入封闭液，以液体展开后刚刚没过膜表面为宜，37℃保温振摇30-60分钟；加入适量一抗(既每毫升封闭液中加入1-5微升抗体），4℃振摇过夜；去除含一抗的封闭液，用漂洗液漂洗硝酸纤维素膜3遍，每遍加20ml漂洗液振摇5分钟，再加入含抗一抗的辣根过氧化物酶酶标二抗的封闭液，37℃振摇保温1-2小时。2.封闭加入封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液或3%BSATBST溶液），以液体展开后刚刚没过膜表面为宜，室温下置摇床1h；3.加入适量一抗（根据抗体说明书确定相应用量），4℃摇床过夜；4.

取出膜条，TBST彻底清洗一抗，加入酶标二抗，37℃保温1h。What’shappen?目的蛋白（抗原）一抗带酶标的二抗3.显色检测：

根据酶标所用酶选用适当的显示方法。本实验采用辣根过氧化物酶标记抗体，相应地采用氯萘酚成色显示方法。倾去含酶标抗体的封闭液，用TBS漂洗硝酸纤维素膜3遍，各振摇5分钟；蒸馏水漂洗1遍，漓去水后在显色液中显色，轻轻振摇至显色深度不再增加，然后放入水中漂洗停止显色，照相存底，移到滤纸上干燥保存。Summary附1：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色显示方法1.固定漂洗（Fixing）：待蛋白电泳进行到溴酚蓝带迁移至距离胶底0.5-1cm处，关闭电源，倾去电极液，卸下胶模，取下胶块浸泡于5倍体积固定液中（只要分离胶）；放置于摇床上振摇30-60分钟。

2.染色（Staining）：弃固定液，加入5倍体积的染色液，于摇床上振摇2-16小时。

3.脱色（Destaining）：倾去染色液，加入5体积脱色液，于摇床上振摇至背景脱净，照相保存结果。

4.干胶保存（GelDrying）：取玻璃板，裁取两张比玻璃板长出和宽出5-6cm的玻璃纸，浸泡入水中10分钟。然后于玻璃板上铺一张浸泡过的玻璃纸，每边超出框架3cm左右，将胶块置中间；再覆盖上一张浸泡过的玻璃纸，注意勿在胶块与玻璃纸之间留存气泡，最后将每边长出的玻璃纸翻向玻璃板下方卷折，四周用夹子夹紧，胶面向上平放过夜干燥保存。WesternBlot常见问题分析SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充