加拿大一枝黄花挥发油化学成分及其抗菌活性研究

加拿大一枝黄花挥发油化学成分及其抗菌活性研究

加拿大的圣杯花是科。这是水稻科的一种。20世纪70年代，它被引入中国作为花卉，然后变成了杂草。现在，它通常分布在上海及其周边地区，在京沪、上海、浙江、江西铁路沿线浙江、宁波、台州等地，造成重大的生态危机。加拿大一枝黄花作为一种庭院装饰植物,于18世纪首次从美洲东北部引入欧洲.在1850年左右从中欧开始传播,并且在1950年左右遍布欧洲.该植物在欧美已经有100多年的药用历史,用于治疗慢性肾炎、膀胱炎、尿结石、风湿、糖尿病等疾病,具有抗氧化、抗菌等药理作用.加拿大一枝黄花与我国传统的药用植物一枝黄花(SolidagodecurrensLour.)为同科同属植物,其药用功效也非常相近,挥发油成分被认为是其主要抗菌活性成分.本文以采自上海江湾机场加拿大一枝黄花茎叶为原料,用水蒸气蒸馏法获得挥发油,采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对其挥发油成分进行了分析鉴定,用色谱峰面积归一化法计算各组分的相对质量百分数.采用平板打孔法,使用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌作为测试菌株,测试了加拿大一枝黄花挥发油的抗菌活性.1.实验仪器与试剂(1)材料植物材料:加拿大一枝黄花(SolidagocanadensisL.)地上部分,2004年9月采于上海江湾机场.供试菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),由复旦大学生命科学学院微生物系钟江教授提供.(2)仪器FinniganVoyager气相色谱-质谱联用仪,美国Finnigan公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;莱利达H2-9211K恒温振荡器,太仓市科教器材厂;GNP-9080型隔水式恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;手提式压力蒸汽灭菌锅,上海华线医用仪器有限公司.(3)试剂酵母提取物(YeastExtract)、蛋白胨(Tryptone)、琼脂粉(AgarPowder)、氨苄西林(Ampicillin)×0.1mg/mL、链霉素(Streptomycin)×0.1mg/mL、四环素(Tetracycline)×0.1mg/mL,OxoidLtd.England;NaCl购自上海文星生化科技有限公司.(4)LB培养基的配制(1000mL)酵母浸膏5g;胰蛋白胨10g;NaCl10g;琼脂20g;pH7.0~pH7.5(用w(NaOH)=10%调至所需pH值).2.方法(1)质谱条件设置采集新鲜加拿大一枝黄花地上部分,切碎,40℃干燥12h.粉碎成粉末状,置于挥发油提取器中,提取4h.提出的挥发油收集于磨口试管中,冰箱保存,供试.在FinniganVoyager气相色谱-质谱联用仪上,采用DB-5石英毛细管柱(30m×0.25μm).柱温60℃(保持2min)至300℃(保持10min),升温速度10℃/min.汽化温度250℃,He(载气)流量为1.0mL/min,分流比100∶1,进样量1.0μL.质谱条件:质谱检测器EI源,电子能量70eV,检测室温度为200℃.各成分通过NIST标准质谱图库进行计算机检索.(2)抗菌圈大小的测定把灭菌后的固体LB培养基自然冷却至45℃,按照液体培养物与固体培养基体积比5%的比例,将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌液体培养物分别加入固体LB培养基,混匀,倒平板.用已灭菌的打孔器在混菌平板每旋转60°打直径5mm的孔,挖去琼脂,共打6个孔.分别在孔内注满挥发油1、挥发油2、浓度为0.1mg/mL的氨苄西林、链霉素、四环素,剩下的一孔作为空白对照,做好标记.37℃培养18h,观察并记录抗菌圈大小.3.结果与讨论(1)化合物结构鉴定对加拿大一枝黄花挥发油挥发油用GC-MS方法进行分析,从中共鉴定出28种成分(见图1和表1),已鉴定化学成分的总含量约占全油的85.88%.其中单萜6个,质量百分数为挥发油总量的24.06%;单萜含氧化合物3个,质量百分数为0.67%;倍半萜13个,质量百分数为56.45%;倍半萜含氧化合物3个,质量百分数为1.08%;二萜1个,质量分数为0.15%;其他化合物共2个,质量百分数为3.37%.其主要成分为大香叶烯D(GermacraneD),D-柠檬烯(D-Limonene),α-蒎烯(α-Pinene)(见图1),质量百分数分别为48.08%,13.82%,6.25%.Danuta等从波兰产加拿大一枝黄花挥发油中鉴定了18个成分,主要成分是γ2-杜松烯(γ2-Candinene),质量百分数为27.1%;夏文孝等从杭州产加拿大一枝黄花挥发油中鉴定了40个成分,其主要成分主要为异大香叶烯D(iso-germacrene-D),质量百分数为34.59%,柠檬烯(Limonene)质量百分数为18.52%.上海产加拿大一枝黄花与波兰和中国杭州所产的加拿大一枝黄花,在挥发油的主要成分和含量上明显不同.(2)加拿大一枝黄花挥发油的抗菌活性平板打孔法是琼脂平板扩散法的一种,该法是利用药物在琼脂中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成抗菌圈,再根据抗菌圈大小判定细菌对药物的敏感性的一种方法.本实验使用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌作为测试菌株,采用氨苄西林(Ampicillin)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)作为阳性对照,空白作为阴性对照,测试加拿大一枝黄花挥发油的抗菌活性.从抗菌效果上来看加拿大一枝黄花挥发油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用,对金黄