锁阳药材的化学成分测定

锁阳药材的化学成分测定

锁阳是锁阳科植物的干燥肉质茎。它是一种常见的中药，具有补肾、助阳、益气、润肠的功效。主要用于阳痿、射精、腰膝酸软、肠干渴、便秘等。又名“乌兰高腰”，用于缓解腹泻和健胃，主要用于肠热、胃炎、斑点和腹泻。现代药理学研究证明,锁阳具有以下药理作用:(1)促进性功能和肾功能;(2)清除自由基、抗氧化及抗衰老;(3)耐缺氧、抗应激、抗疲劳;(4)增强动物的免疫功能;(5)抗癌及抑制艾滋病病毒增殖的作用;(6)抗血小板聚集;(7)润肠通便等。锁阳中含有的主要有效成分有以儿茶素为代表的黄酮类、熊果酸为代表的三萜类、多糖与鞣质等化合物。张思巨等人用高效液相色谱法测定锁阳中儿茶素含量(以干品计)为2.079%～0.076%,并提出以儿茶素作为锁阳指标性成分的意见,我们也认为可以将儿茶素作为控制锁阳药材质量的指标性成分。为此,对不同地区、不同生育期天然和人工栽培锁阳中儿茶素含量进行了测定,为锁阳药材最佳采药期及内在质量标准的制订和其指纹图谱的建立提供科学依据。1药品与成体系的药物试剂试验材料为分别从内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗亿利集团草原青基地、漫赖乡人工栽培锁阳基地、赛音乌苏基地和道图采种基地采集的出土前期(2004-5-7)、出土期(2004-5-7)、开花期(2004-6-16)和结实期(2004-7-25)的锁阳药材样品,自然干燥后,用烘箱(105℃)烘干至恒重。儿茶素对照品(批号为877-200001)购自中国药品生物制品检定所;甲醇为分析纯·;水为超纯水;枸橼酸、N,N-二甲基甲酰胺为分析纯(天津化学试剂公司);四氢呋喃为色谱纯(天津西华特种试剂厂)。仪器为美国Agilent1100Series高效液相色谱仪,Agilent二元泵,G1312A自动进样器,Agilent1100紫外检测器,Agilent1100色谱工作站。2溶液制备2.1对照溶液精密称取儿茶素适量,加50%甲醇配制成90μg·mL-1的对照品溶液。2.2提取液的制备取本品粉末(过100目筛)约0.8g,精密称定,置250mL提取器烧瓶中,加溶剂95%乙醇回流提取2次(第1次40min,加溶剂100mL,第2次20min,加溶剂100mL),过滤,合并滤液,减压回收至干,残渣加50%甲醇溶解,移置25mL量瓶中,用50%甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)过滤,置25mL棕色瓶中,即得。3b-c38柱参照文献基本色谱条件,对其流动相的极性进行了调整。色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm),0.04mol·L-1枸橼酸溶液-N,N二甲基甲酰胺-四氢呋喃(50:4:1)为流动相,流速1.0mL·min-1,检测波长为280nm,柱温:35℃;进样量:30μL。4方法学的检验4.1标准曲线的绘制精密称取儿茶素对照品适量,加50%甲醇配制成90μg·mL-1的对照品溶液,分别精密吸取1,4,8,12,16,20μL,依次进样,按上述色谱条件测定,以儿茶素进样的质量(μg)作为横坐标X,峰面积积分值为纵坐标Y,绘制标准曲线并回归处理,结果表明,儿茶素含量在0.09～1.8μg范围内线性关系良好。回归方程为:4.2精密度测试取同一供试品溶液重复进样5次,每次30μL,儿茶素峰面积积分值的RSD为0.64%。4.3重复试验取同一批样品5份,精密称定,分别按“2.2”项方法制成供试品溶液,测定、计算百分含量,RSD为3.2%。4.4儿茶素峰面积积分值的测定精密吸取同一供试品溶液,在24h内按0,2,4,6,8,24h(8h后置冰箱冷冻室中保存至第16h取出,在第24h测定)间隔进样6次,供试品溶液中儿茶素峰面积积分值的RSD为2.5%。4.5加样回收和rsd精密称取0.7g已测知含量的草原青基地出土前期锁阳样品5份,分别加入对照品溶液2mL,按“供试品溶液制备”方法操作,进样30μL,测得儿茶素的平均回收率为96.36%,RSD为0.90%。5对照品溶液的制备对4个产地的不同生育期锁阳样品分别按“2.2”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项方法制备90μg·mL-1的对照品溶液,按“3”项下条件进行外标法测定。结果见图1、表1、图2。6结论与分析6.1不同的提取方法对锁阳儿茶素含量的影响6.1.1提取时间的影响按上述HPLC色谱条件,对草原青出土前期锁阳样品,用不同时间(1,2,3h)加热回流提取的效率进行了比较研究,结果加热回流提取时间为1h时,儿茶素的得率(72.37mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.2不同功率和时间对细胞破碎仪超声提取儿茶素的效果影响按上述HPLC色谱条件,对草原青出土前期锁阳样品用细胞破碎仪超声(频率20kHz)提取儿茶素,在不同功率(80,100,120W)与时间(20,25,30,35,40min)组合下提取效率进行了比较研究,结果在20kHz,80W,30min组合下,细胞破碎仪超声提取儿茶素得率(52.20mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.3超声波清洗仪提取患儿儿茶素得率按上述HPLC色谱条件,对草原青出土前期锁阳样品用超声波清洗仪提取儿茶素,在相同频率(40kHz)及功率(44W)和不同时间(30,40,50min)组合下的提取效率进行了比较研究,结果提取时间为40min超声波清洗仪提取儿茶素得率(51.90mg·mL-1)最高,效果最好。6.1.4最佳提取条件的确定按上述HPLC色谱条件,对草原青基地、漫赖乡人工栽培基地、赛音乌苏基地出土前期锁阳样品分别用加热回流1h、细胞破碎仪、超声波清洗仪(按上述最佳提取条件)提取后,对提取效果进行了比较研究,结果儿茶素含量加热回流提取>超声波细胞破碎仪>超声波清洗仪,因此选用加热回流提取方法提取儿茶素,用于制备供试品溶液。6.1.5提取效率比较锁阳儿茶素的提取方法的比较研究结果表明,加热回流提取1h比超声波细胞破碎仪和超声波清洗仪2种方法提取效率高。超声波提取方法虽然有对样品无损害、提取简便、快速等优点,但对锁阳儿茶素的提取而言短时间加热回流提取效率比超声波提取效率高。6.2流动相的选择应用文献色谱条件试验时,在保留时间14.84min时出现了儿茶素的色谱峰,但出现拖尾现象。作者怀疑这可能是同别的物质的色谱峰重叠所致,因此对其流动相比例进行了调整。随着流动相中枸橼酸溶液比例的加大,儿茶素的保留时间在14→28min变化过程中,原来儿茶素的色谱峰(14min时)中明显分出另一小峰(约在30min时)。当流动相比例调到50:4:1时,这2个色谱峰达到完全分离,因此本文选择0.04mol·L-1枸橼酸溶液-N,N二甲基甲酰胺-四氢呋喃(50:4:1)为流动相,色谱图见图1。对该方法进行验证,结果证明精密度、稳定性、重现性、回收率等指标都能够符合定量分析要求。因此,该方法能够较精确测量锁阳中儿茶素的含量,可以作为测定锁阳药材儿茶素的方法。6.3出土期间、开花期、粘结期的变化研究结果表明,不同地区、天然的以及人工栽培的锁阳不同生育期儿茶素含量变化趋势是相同的,呈现出规律性地变化,即出土前期>出土期>开花期>结实期。从图2可以看出,不同产地的锁阳在不同生育期儿茶素的含量变化很大,这可能与生长环境的土壤营养、水分、气候等因素有关。6.4黄酮类化合物指纹图谱的建立不同生育期锁阳