猪传染性胃肠炎与流行性腹泻的防治

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻的防治

猪感染性胃肠炎（tge）和猪诱导腹泻（ped）由冠状病毒引起。这种疾病的仔猪主要表现为呕吐、腹泻和脱水。TGE和PED在我国广泛流行,冬春季节经常在猪群中发生,是猪的常见多发病。这两种病在流行病学、临床症状上十分相似,具有发病突然、传播迅速、流行面广和各年龄猪只均可感染的特点。其发病率和死亡率较高,对仔猪危害严重,给养猪业造成了严重的经济损失,成为困扰世界养猪业发展的难题。接种疫苗是预防和控制猪冠状病毒性腹泻的主要方法,现就目前这两种猪冠状病毒性腹泻疫苗的研究现状做一概述。1tgev血清学分型猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病。TGEV只有一个血清型,可使各年龄猪发病,其中2周龄内仔猪死亡率可达到100%。人类从1946年发现本病就开始研究免疫控制技术,大致经历了四个阶段。1.1成年猪场污染严重TGE的暴发常常是在买进猪只后的3～5d。猪场第一次暴发TGE时,初生仔猪几乎100%死亡,损失严重。人们采用发病猪的肠内容物和粪便感染全场成年猪,尤其是妊娠母猪,使之产生免疫力,通过初乳保护仔猪。这个办法虽然使仔猪得到保护,但是场地受到严重污染,始终有强毒存在。腹泻发病率虽然降低,但常年发生,该方法已被禁止使用。1.2原代胎猪肾细胞马思奇等用TGE华毒株人工感染1日龄未吃初乳新生猪,适时剖杀收获小肠组织毒,使之适应原代胎猪肾细胞。用低代次毒的仔猪肾细胞培养物经甲醛灭活后,加氢氧化铝佐剂制成TGE灭活苗。灭活苗解决了场地环境污染问题,但其免疫应答产生较慢,不能激发产生以SIgA抗体为主的黏膜免疫反应,且制苗成本昂贵。1.3苗接种途径免疫妊娠猪毒株主要有美国的TGE-Vac株、匈牙利的CKP株和日本的TO-163株等。我国的TGE华毒株是在原代胎猪肾细胞上经165次传代致弱,其间又经5次克隆纯化筛选获得。用该毒株生产的疫苗接种途径为鼻黏膜和肌肉注射。国外学者Aynaud将TGEV突变株188-SG致弱后分别通过口服、肌肉注射、眼结膜途径免疫妊娠母猪,从而使哺乳仔猪得到保护。实验结果显示,必须经过多次免疫才能起到良好的免疫效果。弱毒苗能刺激黏膜免疫,肌肉注射产生抗体快、水平高,欧美现使用的疫苗主要是弱毒苗。弱毒疫苗对预防该病的发生起到了重要的作用,但同样存在其他弱毒疫苗所存在的易返祖、有潜在感染危险等缺陷。综上所述,灭活苗和弱毒苗都存在不同的缺点。因此,研究者们在努力探索能更加有效地防治该病的新型疫苗。基因工程疫苗的出现为该病防治的研究提供了新的思路。1.4tgev蛋白在细胞生物学检测基因结构研究表明,TGEV基因组主要由纤突糖蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、小膜蛋白(SM)组成。纤突蛋白基因(S)是TGEV的主要结构蛋白基因,全长约4.3kb,位于病毒的最外面,编码病毒的纤突蛋白,是诱导机体产生中和抗体的主要抗原,并对病毒的毒力、组织嗜性、受体结合位点、血凝性等起着重要的生物学作用,是免疫预防和诊断研究的重点。目前,国外学者已对TGEV不同毒株的S蛋白进行了大量研究,证明在S蛋白氨基端含有A、B、C、D四个抗原位点,其中诱导中和抗体产生的主要是A位点。不同分离株的A、B和D位点高度保守,C位点稍有变异,但对其诸多功能的作用机理还不清楚。N蛋白在不同地区的TGEV分离株中均高度保守,在病毒的致病性及病毒复制和转录过程中发挥重大作用。因此,在研制基因工程疫苗时,这两个蛋白应用较多。1.4.1使用s蛋白亚单位苗进行加强免疫Saif等用杆状病毒为载体在昆虫细胞系表达S基因,提取蛋白制成亚单位疫苗,在妊娠母猪免疫弱毒苗后,使用此亚单位疫苗进行加强免疫,可显著提高母猪血清和初乳的抗体水平,其对仔猪的保护率比弱毒苗两次免疫还高14%,但S蛋白亚单位苗单独免疫效果不佳。Streatfield等用谷物作为重组体植物表达载体表达TGEVS蛋白,制备的亚单位疫苗可有效提高母猪血清、初乳的中和抗体水平。1.4.2tgevs基因缺失菌株Britton等将TGEV英国分离株S基因的cDNA插入到痘苗病毒胸苷激酶基因中,重组S蛋白在质膜上表达。S蛋白的单克隆抗体能与该重组S蛋白反应,用重组痘病毒感染小鼠后表达了S蛋白,产生了TGEV中和抗体。Nagy构建了5个不同血清型的重组猪腺病毒,经口接种易感猪后,免疫猪未出现临床症状,直到感染6～7d后才可从直肠棉拭子中检测到病毒,重组病毒诱发了针对TGEV的特异的病毒中和抗体,而且在免疫猪的小肠和肺脏中检测到TGEV分泌型IgA抗体。Li应用猪伪狂犬病病毒(PRV)为载体表达TGEVS基因的主要抗原位点,以期制成TGEV/PRV二联苗,有效防治这两种猪传染病的发生。ChenH将TGEVS基因的A位点和C位点插入到疫苗株鼠伤寒沙门氏菌苗的菌毛中,经口免疫BALB/c小鼠,发现诱导的抗体能识别TGEVS蛋白的抗原位点。Liu等将N基因全序列的cDNA插入哺乳动物表达载体(pcDNA3.1)中构建了重组质粒(pcDNA/N),将构建的载体免疫鼠后,能诱导鼠体产生针对传染性胃肠炎病毒N蛋白的体液免疫反应和细胞介导的免疫反应,但所产生的抗体没有中和活性。1.4.3基于pci的tgevn抗体师东方等以真核表达载体pcDNA3.1(+)表达TGEVTH98株N基因,构建了重组真核表达载体pcDNA-N。免疫昆明鼠后,在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。任晓峰等应用pCI新型真核融合表达载体分别表达TGEVTH-98株的全长S基因和主要抗原位点(A、B、C、D)的Sa片段,构建了含有TGEV全长S基因和主要部分S基因的核酸疫苗,将重组核酸疫苗免疫小鼠后发现pCI-Sa的免疫效果优于pCI-S。核酸疫苗既有亚单位疫苗的安全性,又有弱毒疫苗的有效性,能同时诱导机体产生体液和细胞免疫应答,符合用一种疫苗预防多种传染病的需求。1.5tgev基因表达Gomez将TGEV的S基因克隆到花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子下游,转染到植物种子中,植株生长的大多数叶子可用特异性单克隆抗体检测到S基因表达的多肽,从而成功地构建了TGEV转基因植物疫苗。用这种植物饲喂猪,产生了中和抗体和免疫保护作用。随后,Gomez又用转基因马铃薯表达了包含有TGEV糖蛋白S氨基端区域(N-gS)的主要抗原位点。将表达N-gS的马铃薯块茎提取物腹腔内免疫小鼠,接种的小鼠血清中具有对TGEV特异的抗体IgC。而且用表达N-gS的马铃薯块茎直接饲喂小鼠时,小鼠血清中产生了对糖蛋白特异的抗体,表明了从植物中提取的TGEV纤突蛋白有经口免疫原性。1.6小鼠肠道免疫指标检测Kwang等将TGEV的S基因克隆到乳酸杆菌/大肠杆菌穿梭载体中,将表达分泌S蛋白的乳酸杆菌经口免疫BALB/c小鼠,可诱导小鼠产生局部黏膜免疫和全身免疫应答,32d后在小鼠血清中检测到IgG含量为(8.38±0.19)ng/mL,肠道中IgA含量为(64.82±2.9)ng/mL,说明该疫苗可有效预防TGEV感染。2ped的结构蛋白PEDV是1977年由比利时病毒学家Pensert发现并证实其与TGEV无血清学交叉反应,是一个新发现的冠状病毒,并将分离到的病毒命名为cV777株,其引起腹泻的症状与TGE十分相似。PED的结构蛋白与其他冠状病毒相似,主要有S、M、N蛋白。其中,S蛋白由S基因编码,可刺激机体产生中和抗体。S蛋白在免疫介导中起着重要作用。S蛋白还具有其他生物学作用,如识别靶细胞,促进病毒和细胞膜的融合。国内外关于PED疫苗的研究相对较少,已研制的疫苗包括组织灭活苗、细胞灭活苗、细胞弱毒苗和转基因植物疫苗等。2.1剖杀和接种1993年哈尔滨兽医研究所王明等首次报道用PEDV沪毒株给仔猪口服,待发病重剧时剖杀,取肠内容物和小肠黏膜制成乳剂,加甲醛灭活用氢氧化铝为佐剂制成组织灭活苗,经后海穴接种,结束了PED无疫苗的历史。虽然免疫效果很好,但生产成本偏高,产品质量难于控制。2.2氢氧化铝灭活苗的制备1994年马思奇等通过培养液中加入胰酶增强病毒对细胞的吸附,将PEDVcV777适应Vero细胞后,以28代毒制备氢氧化铝灭活苗。目前通过Vero细胞静态培养增殖PEDV,制备的细胞灭活疫苗已被广泛应用。2.3与tgev弱毒苗的免疫试验研究由于灭活苗产生完全免疫力需要2周时间,且剂量偏大,不利于紧急预防与降低疫苗费用,所以又研制了细胞弱毒苗。国内佟有恩等用cV777株强毒株适应Vero细胞系,并在83代后适应了仔猪肾原代细胞。以104～124代细胞适应毒制备5批疫苗,免疫试验的总保护率为95.92%;以106～139代细胞适应毒制备的8批疫苗,免疫试验的总保护率为96.2%。在与TGEV弱毒组合制备的二联弱毒苗的初步田间试验中取得良好效果。国外Kweon等用分离到的野毒株(命名为KPEDV-9),使之适应Vero细胞并连续传代至93代,接种妊娠母猪。ELISA检测结果表明,母猪免疫应答水平大幅度提高,且新生仔猪可抵抗PEDV野毒感染。Park等将PEDV经Vero细胞致弱后的毒株DR13,通过口服和肌肉注射两种途径免疫晚期妊娠母猪,检测所产仔猪的发病率。结果口服免疫组的发病率(13%)远低于肌肉注射免疫组(60%),且口服免疫组仔猪抗PEDV的SIgA含量高于肌肉注射免疫组。研究表明,可应用PEDV细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪,从而有效预防PEDV感染。2.4对小鼠的免疫作用Yang等于2003年将PEDV的S基因转入烟草中,提取转基因植物蛋白给小鼠注射,进行血清蚀斑减数中和测定,证明其具有免疫原性。给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫。2005年,Yang等相继应用农杆菌介导的蛋白转入法将PEDV的S基因的主要抗原位点(命名为K-COE)和合成的PEDV中和抗原表位在烟草中表达,前者重组体蛋白占转基因烟草叶片总可溶性植物蛋白含量的0.1%,后者含量则为2.1%。这些研究为研制PEDV口服转基因植物疫苗提供了新的思路。3联苗3.1联苗的免疫特性该系列产品包括猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)二联灭活苗及二联活疫苗,是由中国农科院哈尔滨兽医研究所的马思奇、佟有恩共同支持完成的。该二联疫苗的特点是:毒价高,后海穴接种(是对常规免疫途径的突破),增强了免疫保护力,一次接种即可,省时、省力。经国内外联机检索查新证明,该二联苗是国际领先研制成功的,并在技术上有原始创新。两种疫苗主要用于妊娠母猪的被动免疫以保护仔猪,也用于主动免疫保护不同年龄的猪只。其中二联灭活苗主动免疫保护率为96%,被动免疫保护率为85.1%;二联活疫苗主动免疫保护率为97.7%,被动免疫保护率为98%。两种二联疫苗的免疫期为6个月,仔猪被动免疫期是哺乳期至断奶后1周。灭活疫苗在免疫后l4d产生免疫力;二联活疫苗免疫后7d产生坚强的保护。3.2作用于生物培养物的制备上海农科院畜牧兽医研究所钱永清等人采用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒细胞培养物制备了三联灭活疫苗。实验室免疫结果表明,育肥猪和妊娠母猪免疫后15d达到较高的免疫水平,免疫有效期超过6个月,妊娠母猪所产仔猪可获得高水平的被动免疫保护。试验场应用结果表明,母猪保护率达98%,仔猪被动免疫保护率达93%。4冠状病毒性腹泻疫苗TGEV和PEDV致病机理十分相似。病毒通过消化道进入仔猪体内,它们的靶细胞都是肠绒毛上皮细胞,引起肠绒毛的萎缩脱落,是导致动物消化紊乱、酸中毒和脱水的原因。在预防上,如果在肠腔内经常有抗体存在,就可以不断中和猪体摄入的病毒,从而起到保护作用。目前,国内外市场使用的仔猪冠状病毒性腹泻疫苗主要有3种:一是灭活苗,因为只能通过注射免疫,仔猪无法获得SIgA,保护效果不佳;二是弱毒苗,由于存在着成本高、易返祖、有潜在感染危险等缺陷,很难在实践中推广应用;三是强毒疫苗,主要用于妊娠母猪免疫使新生仔猪获得被动保护,但由于病毒毒力过强,有使母猪流产和散毒的危险,不能为养猪业者接受。大量研究结果表明,仔猪主要通过初乳获得母源SIgA,产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护,血清中的循环抗体IgG不能提供保护,经非肠道免疫不能产生母源免疫。因此,黏膜免疫是使仔猪获得免疫保护的重要途径。所以,探索安全、有效、廉价、可以诱导黏膜免疫的新型疫苗,是今后的研究方向。5价格补充5.1dna疫苗的作用核酸疫苗又称为基因疫苗、DNA疫苗,是20世纪90年代初从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗,与传统的弱毒或灭活疫苗相比,DNA疫苗具有不散毒、不返强的优点。与亚单位疫苗相比,具有能长期激发机体体液和细胞免疫反应、制备工艺简单和费用低廉(不用纯化蛋白)的优点。另外,DNA疫苗还具有可以制成标记性疫苗,便于临床诊断监测;疫苗性质稳定,便于储存和运输;应用范围广,不仅可用于传染病和寄生虫病的免疫预防,而且还能够用于肿瘤、自身免疫、过敏反应等疾病的治疗等优点。猪冠状病毒性腹泻核酸疫苗的研究还处于起步阶段,是今后研究的热点之一。5.2tge和ped的冷刺剂在合成基因疫苗中的应用随着植物高效基因载体系统和遗传转化技术的发展,利用转基因植物生产人或动物基因工程疫苗用于疾病的预防及治疗已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。与传统疫苗生产系统相比,转基因植物基因工程疫苗具有植物细胞的全能性。口服植物疫苗