玉米穗轴色素的分析研究

玉米穗轴色素的分析研究

黑玉米是水稻科的一种不同于水稻科的玉米。它是水稻品种的一种新品种。换句话说，谷物的颜色是深绿色、紫绿色、蓝色和黑色。由于粮食中含有大量的颜色转换化合物，因此该菌株的谷物呈黑色。大量研究表明:花色苷具有抗氧化作用、抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜等多种功能,随着人们食品安全意识的增强,化学合成色素的使用越来越受到限制,而多数天然色素安全无毒,有些还具有营养和医疗价值,深受人们的欢迎,花色苷类色素作为一类具有很高开发价值的天然色素也受到很大的重视。广东省农业科学院作物研究所,自1990年从秘鲁引进黑玉米资源,经过长期选育培育成了籽粒、穗轴、苞叶和茎杆全部紫色的粤紫金黑玉米自交系及组合,具有明显的特异性,在国内并不多见,其所含的色素的利用潜力非常大。论文对从粤紫金黑玉米穗轴提取的色素进行了分离纯化,利用多种方法进行色素所含花色苷成分的结构的初步鉴定,为其进一步开发利用奠定基础。1材料和方法1.1试剂与仪器黑玉米(BL1)由广东省农业科学院作物所提供;浓盐酸、KBr广东光华化学厂有限公司;甲醇天津市红岩化学试剂厂;乙醇天津市诺克科技有限公司;冰醋酸天津市百世化工有限公司;正丁醇天津市化学试剂厂;AB-8树脂天津大学化工厂;AlCl3上海美光化工股份有限公司;以上所有试剂均为分析纯。FW-100高速万能粉碎机、DZKW电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂;SHZ-D循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司;RE-52AA旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;雷磁PHS-3C精密pH计、FD-1B-50冷冻干燥机上海精密科学仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;VECTOR33型红外色谱仪德国Bruker公司。1.2实验方法1.2.1提取液的制备将黑玉米的穗轴用粉碎机粉碎后经分级筛选得40目穗轴干粉。用pH=2的80%乙醇溶液在固液比为1∶5的条件下,45±2℃恒温水浴4h,用真空泵和耐酸过滤漏斗得到色素提取液。利用旋转蒸发仪将色素提取液浓缩至原来的50%。1.2.2黑玉米色素的最佳展开剂的筛选采用环形法(辐射法)纸层析,以正丁醇、冰醋酸和水作为展开剂,在同样的点样条件下,不断调整三者比例:4∶1∶6、4∶1∶5、4∶1∶4、4∶1∶3、4∶1∶2、4∶1∶1、4∶1∶0.5、5∶2∶1、6∶1∶1,根据纸层析的色带情况,筛选黑玉米色素的最佳展开剂。在最佳展开剂下利用纸层析分离黑玉米色素,将得到的单独色谱带分别剪下,以0.01%HCl-MeOH溶液浸泡12h,过滤,用旋转蒸发器于50℃以下真空浓缩。1.2.3盐酸v水展开剂的配制:BAW:正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶5(上层);BuHCl:正丁醇∶2mol/L盐酸=1∶1;1%HCl:V(浓盐酸)∶V(水)=3∶97;HAc-HCl:V(冰醋酸)∶V(浓盐酸)∶V(水)=15∶3∶8。取4个层析筒,分别加入BAW、BuHCl、1%HCl、HAc-HCl为展开剂,将4张点有分离后样品的层析滤纸放入层析筒中,于30±1℃下预先平衡15min,再上行展开,当展开剂前沿达滤纸上方约3~4cm处时,终止纸层析,将层析纸晾干后观察色斑,测量Rf值,并与文献中的Rf值进行比较。1.2.4紫外光谱扫描对分离纯化得到的黑玉米色素0.01%HCl-MeOH液进行紫外光谱扫描,红色素浓度的高低以扫描图中可见光区最高峰的位置适宜为准,用0.01%HCl-MeOH液作参比,扫描范围200~800nm,为确定最大吸收峰有无红移现象,在比色皿中再加入2~3滴5%AlCl3甲醇液,搅匀静置10min后,按上述条件作紫外光谱扫描。1.2.5黑玉米色素的纯化按照文献中的方法用大孔树脂AB-8进行预处理,将100mL色素提取液放入置有预处理好的30g大孔树脂的250mL具塞磨口三角瓶中,置恒温振荡器上于30℃,180r/min振荡24h,充分吸附后过滤,将滤出的树脂加入到100mL,80%的乙醇溶液中,置振荡器上于30℃,180r/min下振荡24h,充分解吸后过滤,即得纯化后的黑玉米色素样品。将纯化后的色素样品按前法用纸层析进行分离,并利用洗脱剂对每个独立的色带分别进行洗脱,收集其洗脱液,冷冻干燥,并用KBr压片,采用红外光谱仪作傅立叶红外光谱扫描,获得样品的红外光谱图。2结果与分析2.1水民红色开析在用纸层析法对黑玉米穗轴色素进行分离研究中发现,当展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶5时,层析效果最好,从内至外依次出现紫红色、桔红色、浅红色三条明显色带,且各色带之间分离得很开,没有拖尾现象。其他配比展开剂的展开效果都不理想。黑玉米穗轴色素纸层析的最佳展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶5。2.2红色素衍生物的检测黑玉米穗轴色素提取液经BAW(4∶1∶5)采用环形法进行纸层析分离后,可以分辨出明显独立的3条色谱带,由内至外编号为1#、2#和3#,其结果见图1。将三条色带分别经BAW进行第二次层析后均得到单一色带,证明经过纸层析后获得的色素样品较纯。观察发现,1#色谱带呈紫红色,2#色谱带呈桔红色,3#色谱带呈浅红色。从色带的面积观察:2#色素含量最多,3#色素含量最少。前人的研究结果表明,食品中6种主要红色素衍生物的颜色从桔红到紫红按结构顺序排列为天竺葵素、矢车菊素、芍药色素、锦葵素、牵牛花素和飞燕草素。因此,从色带颜色看,1#至3#色素带可能是天竺葵素、矢车菊素或芍药色素的衍生物。2.3展开剂的rf值对黑玉米穗轴色素所含的3种花色苷采用纸层析法进行鉴定,其Rf值见表1。前人的研究结果表明,矢车菊-3-葡萄糖苷在BAW、BuHCl、1%HCl和HAc-HCl展开剂中的Rf值分别为0.38、0.25、0.17、0.26;芍药定-3-葡萄糖苷在上述4种展开剂中的Rf值分别为0.41、0.30、0.09、0.33;天竺葵-3-葡萄糖苷为0.44、0.38、0.14、0.35。相比较后可以发现,该黑玉米穗轴色素所含的1#花色苷在各种展开剂中的Rf值与矢车菊-3-葡萄糖苷相似,2#花色苷与芍药定-3-葡萄糖苷相似,3#花色苷与天竺葵-3-葡萄糖苷相似。2.4花色苷的紫外吸收图谱根据Harborn所述,不同类型和结构的红色素化合物表现出的紫外可见光谱图有很大的差异。可以根据其紫外可见光谱图对花色苷的类别做初步的鉴定。图2~图4分别是1#、2#、3#花色苷在0.01%HCl-MeOH液中,加入AlCl3前后的吸收光谱图。表2是三种花色苷的光谱数据。分析结果发现,1#花色苷在紫外区有两个最大吸收光谱图,吸收峰,为218nm和281nm,其中281nm处吸收峰为花色苷类物质的特征吸收峰。可见区的最大吸收峰为530nm,最大吸收峰在加入5%AlCl3后发生波长红移现象,波长位移的程度为18nm,表明1#花色苷在B环上有相邻的羟基存在;2#、3#花色苷在紫外区均有两个最大吸收峰,分别为218nm和281nm219nm和284nm,其中280nm附近吸收峰为花色苷类物质的特征吸收峰。可见区的最大吸收峰分别为527nm和513nm,最大吸收峰在加入5%AlCl3后无波长红移现象,表明2#、3#花色苷在B环上无相邻的羟基;另外,根据A440/Amax百分比可得出,三种花色苷均在3位有取代基。根据3种花色苷的最大吸收峰的波长、A440/Amax值及加入AlCl3后位移值,与相关文献进行对照,发现1#、2#、3#花色苷的紫外-可见光谱数据分别与矢车菊-3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和天竺葵-3-葡萄糖苷相符。2.5花色苷的特征吸收峰黑玉米穗轴色素中所含的1#、2#花色苷的红外光谱图见图5和图6(由于3#色素含量较少,对其进行冷冻干燥处理时未获得样品)。一般来说,花青素色素红外光谱的吸收光谱可包括四个部分,苯环、含氧杂环、糖和-OH、-OCH3。a.苯环:苯环及杂环中的C-C键能在1605~1485cm-1引起3个吸收峰,苯环中的C-H键所引起的吸收峰范围在900~800cm-1中;b.杂环:杂环中的C=O出现的吸收峰为1630~1620cm-1;c.葡萄糖:花青素色素分子中葡萄糖引起的吸收峰可在1635~1460cm-1出现四个特征吸收峰;d.-OH基及-OCH3基:花青素色素分子中-OH基及-OCH3基引起的吸收峰为1120~1010cm-1,其中矢车菊素为1020cm-1,芍药定为1030和1015cm-1。对比图5及图6,在对应范围内均能找到相应数目的吸收峰,证明所分离出的1#、2#花色苷均含有苯环、含氧杂环、葡萄糖和-OH基及-OCH3基的基本结构,与文献中所描述的特定花色苷的特征吸收峰相对比,可以得出,1#、2#花色苷分别具有矢车菊-3-葡萄糖苷和芍药定-3-葡萄糖苷的基本结构。根据上述的实验结果初步推测,该黑玉米穗轴色素的三个主要成分分别为矢车菊-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside)、芍药定-3-葡萄糖苷(Peonidin-3-glucoside)和天竺葵-3-葡萄糖苷(Pelargonidin-3-glucoside)。3花色苷类色素3.1