低氧性肺动脉高压无肌性肺动脉肌化的细胞来源

低氧性肺动脉高压无肌性肺动脉肌化的细胞来源

低氧化性动脉高压（hph）包括高氧化性肺血管收缩反应（hp）和低氧化性肺血管重建（hpsr）。HPH早期出现HPV,慢性期形成难以逆转的HPSR。HPSR总的病理特征是肺血管壁细胞增殖,合成细胞外基质增多,管壁增厚管腔狭窄。腺泡内无肌型动脉肌化,是低氧性肺动脉高压形成过程中重要的肺血管重塑,而无肌型肺动脉肌化的细胞来源是研究防治肺动脉高压的重要课题之一,但目前对其细胞来源的机制尚未完全明了。成肌纤维细胞(MF)是一类特殊的成纤维细胞,其超微结构特征介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间。MF胞浆中含有大量的收缩性粗丝和细丝,散在分布浓缩小和合成性细胞器。缺氧诱导成纤维细胞转化为成肌纤维细胞可能是HPH肺动脉无肌性动脉肌化的重要细胞来源。我们的实验通过观察HPH形成过程中无肌性动脉肌化的细胞来源,以探讨MF在HPH发生发展中可能的作用。材料和方法1.低氧动脉氧化实验雄性Wistar大鼠40只(中南大学湘雅医学院实验动物中心),体重(220±10)g,随机分为5组:常氧对照组(C组),低氧3、7、14、21d组,每组8只。按本室报道方法复制低氧性肺动脉高压大鼠模型,低氧组置于常压低氧舱内,保持氧浓度为(10±0.5)%,氧浓度仪(HT6101,四川康达电子有限公司)监测低氧箱内浓度。舱内的CO2与水蒸气分别用钠石灰和无水氯化钙吸收,每天缺氧8h,分别缺氧3、7、14、21d,常氧组置同一房内饲养。2.肺动脉平均压mpap大鼠经1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内麻醉后,按徐平等报道方法自右颈外静脉插入微导管,通过压力传感器接上Powerlab(美国匹兹堡AD器械公司)测大鼠肺动脉平均压(mPAP),常氧组于H7组后检测。3.右心室基肥lv和左心室室间隔lvs的计算经以上检测后将大鼠处死,取出心脏置10%缓冲甲醛固定48h,分离右心室(RV)和左心室﹢室间隔(LV﹢S),分别称量RV和LV﹢S的重量,计算右心室肥大指数(RVHI)及[RVHI﹦RV/(LV﹢S)%],确定有无右心室肥厚。4.肺小动脉管密度及并发症的测定取大鼠肺组织以10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,厚度4μm,HE染色,每只大鼠随机选3张肺组织切片,每张切片随机选取断面积较圆的直径100μm-150μm左右的细小动脉5支用PIPS-2020型图像分析仪,进行图像分析,测定肺小动脉管壁面积/管总面积(WA%)、管腔面积/管总面积(LA%)、肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度(SMC,每1000μm2中细胞核数)、肺小动脉中膜厚度(PAMT),作为肺小血管重塑指标。5.iapa所占血管的百分值对照组、不同时间点实验组每只大鼠左肺组织石蜡切片,HE染色,光镜下观察,选择切面为圆形和类圆形的小动脉,计数单位面积(25mm2)内IAPA的总数,并分别计算环肌型动脉(CMA)、部分肌型动脉(PMA)、无肌型动脉(NMA)所占血管的百分值。6.sabc反应石蜡切片脱蜡至水,3%H2O2阻断内源性酶,滴加封闭液20min,加兔抗鼠α-SMA单克隆抗体(博士德公司),4℃过夜,加二抗,SABC反应,DAB显色。用PBS替代一抗或二抗,作为阴性对照组。观察腺泡内肺动脉免疫组织化学染色阳性部位,在相同的倍数下,每组随意选取10条伴行呼吸性细支气管(RB),10条伴行肺泡管(AD)的肺小动脉,经PIPS-2020型全自动图像分析仪测定肺小动脉壁阳性染色物质的平均吸光度,以表示IAPA管壁骨架蛋白α-SMA表达的相对量。7.组织病理学观察取右肺下叶末梢肺组织并固定,标本大小为1mm3,取4-5块肺组织固定于冷2.5%戊二醛,按常规电镜样本制备方法,1%锇酸后固定,环氧树脂618包埋,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,每例电镜观察1-2块组织,使用的电镜为日立电镜(JEO-1200)8.统计处理数据以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS10.0统计软件进行组间t检验与X2检验。结果1.大鼠右心室基肥实验结果显示,从低氧7d起mPAP较对照组明显增高(P<0.05),14d达高水平稳定期;RVHI则从低氧14d起较对照组升高(P<0.05),说明此时大鼠已形成右心室肥厚(表1)。光镜下可见对照组大鼠肺小动脉管壁薄,低氧3天肺动脉尚无明显HPSR,低氧14d可见直径100μm~150μm的小动脉中层平滑肌增生,管壁增厚,管腔变窄,低氧14d和21d平滑肌增生更显著,管腔进一步狭窄。2.种血管的构成比随着低氧时间的延长,肺组织内IAPA数目增多,无肌型动脉减少(图1),从低氧7d开始,IAPA三种血管的构成比与对照组差异有显著意义(P<0.05)。随着实验天数的增加,IAPA中的CMA、PMA构成比逐渐升高,以CMA升高幅度明显,NMA占位减低。3.低氧时间对iapa小动脉管路表达的影响在正常对照组肺血管和支气管平滑肌表达α-SMA(图2),腺泡内肺动脉表达α-SMA较稀少(图3),随着低氧时间的延长,IAPA管壁的α-SMA逐渐增多,尤以伴行腺泡管的小动脉管壁表达量升高幅度较明显(图4、5、6、7)。对伴行RB和AD的肺小动脉管壁表达产物进行图像分析及统计结果(表2)低氧7d开始α-SMA表达与对照组比较差异有显著性(P<0.01)至低氧14d、21d达高水平。4.胞浆内质网正常对照组的肺微动脉,血管壁由内皮细胞、单层弹力膜及少量成纤维细胞构成(图8),成纤维细胞呈梭形,胞浆内有丰富的粗面内质网,线粒体和微肌丝的含量较少,无基膜存在。低氧21d管壁增厚,构成管壁的位于内外弹性膜之间的主要细胞胞浆内出现大量的微肌丝,以质膜下分布最多,成束的微肌丝交错处有致密体形成,细胞质膜处有不连续的基膜存在,呈现成肌纤维细胞表型,外层具有与它紧密联系的成纤维细胞(图9)。低氧动脉盗血低氧的肺循环作用无肌型肺小动脉(NMA)是肺循环中的重要容量型血管,在低氧和炎症等因素作用下,其管壁出现中膜平滑肌细胞,而使肺循环阻力型血管增多,容量型血管减少导致肺动脉压升高。有关NMA结构重塑中的平滑肌细胞来源问题,可能与以下原因有关:(1)由部分肌型肺动脉的平滑肌细胞增生向远侧端无肌型动脉延伸而来;(2)原来位于内皮细胞下的中间型细胞分化成平滑肌细胞;(3)血管外膜和肺间质的成纤维细胞从弹力板窗孔迁入内皮下,沿血管长轴排列,进一步分化为成肌纤维细胞。本组研究显示,低氧使大鼠肺动脉压升高,肺小动脉重塑乃至右心室肥厚,说明低氧是形成肺动脉高压和肺血管重塑的重要原因,抑制HPSR的形成并逆转肺动脉高压是治疗HPH的关键。正常时NMA在IAPA中占65%,PMA和CMA分别占35%和5%。在本实验中,从低氧7d开始,NMA比例明显减少,占39%。而PMA和CMA占46%和15%,有显著意义,说明无肌型动脉肌化是低氧性肺动脉高压形成过程中的重要肺血管重塑。伴行RB的肺小动脉管壁α-SMA表达量随着低氧时间的延长而增多,提示中膜细胞增多,伴行AD的肺小动脉管壁骨架蛋白α-SMA表达量也随着低氧时间的延长而增多,提示有两种可能:(1)管壁原有的平滑肌细胞增生;(2)原有的成纤维细胞或中间型细胞向平滑肌细胞转化(成纤维细胞不表达α-SMA)。电镜结果显示,组成无肌型肺动脉壁的细胞只有内皮细胞,成纤维细胞和少量中间型细胞,在内皮细胞基底面和成纤维细胞向腔面,均有较多的细胞微突,这些细胞突起可穿过单层弹力膜窗孔而相互接触,传递着细胞信息。已知低氧可促发内皮细胞旁分泌许多细胞因子(如ET、PDGF和TGF-BETA等),这些因子可能通过受体激活信息传递途径,促进肺动脉成纤维细胞增殖、趋化或表型转化。MeganShort等研究表明缺氧通过上调α-SMA表达诱导血管成纤维细胞转化为成肌纤维细胞,α-SMA蛋白水平增长通过Gα1和C-Jun信