锁阳熊果酸乙醇提取工艺研究

锁阳熊果酸乙醇提取工艺研究

香阳是多年生、完整的种子植物。这种植物是一种肉质和棕棕色的植物，通常属于白刺科。锁阳是一种常用中药材,性甘、温,具有补肾助阳、益精血、润肠通便、养筋之功用。研究表明,锁阳具有增强免疫、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、防治心血管疾病、抗应激、抗胃溃疡、促进机体性成熟等作用。锁阳中含有黄酮类、三萜类、鞣质类、多糖、氨基酸、有机酸、甾体类等活性成分。熊果酸(Ursolicacid),又名乌苏酸、乌索酸、α-香树脂醇,是一种弱酸性五环三萜类化合物。熊果酸具有镇静、抗肿瘤、抗菌抗病毒、降血脂、降血压、抗氧化、抗艾滋病等作用。熊果酸的提取方法有回流提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界萃取法、索氏提取法、渗漉法等。目前关于锁阳熊果酸的提取工艺研究鲜有报道,本研究以甘肃敦煌地区产的锁阳为原料,采用响应面法优化锁阳熊果酸的乙醇回流提取工艺,为锁阳的开发利用提供基础数据。1材料和方法1.1锁阳科锁阳属植物锁阳锁阳,取自甘肃敦煌,经吉林工程技术师范学院生物工程教研室李皓教授鉴定为锁阳科锁阳属植物锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.);熊果酸(纯度≥98%),成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙醇、乙腈,色谱纯,天津市康科德科技有限公司;磷酸,优级纯,北京化工厂。1.2仪器、设备和仪器Agilent1260液相色谱仪(WondaSilC18色谱柱4.6nm×150nm,5μm,DAD检测器,安捷伦科技有限公司),FW177中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)型台式四表四抽循环水真空泵(上海标和仪器有限公司),HWS-24电热恒温水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司),AL104电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司],RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),DHG-9075A鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。1.3方法1.3.1流动相v色谱柱WondaSilC18分析柱(4.6nm×150nm,5μm),流动相V(甲醇)∶V(0.5%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=80∶15∶5,流速1mL/min,检测波长210nm,柱温35℃,进样量10μL,数据处理为外标法峰面积定量。熊果酸标准品和锁阳熊果酸的HPLC色谱峰见图1。1.3.2熊羧酸的测定标准溶液的配制。称取熊果酸对照品4.10mg,置于10mL容量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,得含熊果酸0.41mg/mL的对照品储备液。精密吸取熊果酸对照品储备液0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0mL,置10mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度。测定时进样量10μL。绘制峰面积—对照品浓度标准曲线,得到回归方程:y=3.86455x-5.63485,R2=0.99891,熊果酸在0.082~0.82μg/mL范围内呈线性关系。1.3.3熊乳酸提取量的测定将锁阳干燥,粉碎,过筛网孔径0.25mm的标准筛。称取5.00g锁阳粉末,乙醇回流提取,过滤,滤液减压浓缩,然后在水浴上蒸发至干,残渣用甲醇溶解,定容至10mL,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,按照标准曲线绘制方法测定提取液中熊果酸浓度,计算熊果酸提取量,公式:熊果酸提取量(mg/g)=提取液中熊果酸质量(mg)/原料质量(g)。1.3.4熊羧酸提取试验(1)单因素试验。设定乙醇溶液体积分数75%,液料比15∶1(mL∶g),提取温度85℃,提取时间1.5h,提取1次,固定其他条件,分别考察乙醇溶液体积分数(35%,45%,55%,65%,75%,85%,95%)、提取温度(35,45,55,65,75,85,95℃)、提取时间(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0h)、液料比(9∶1,12∶1,15∶1,18∶1,21∶1,24∶1,27∶1)对熊果酸提取量的影响。(2)响应面试验。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,设计4因素3水平的响应面分析试验,采用软件DesignExpert8.0.7.1处理数据,优化锁阳熊果酸的乙醇回流提取工艺。(3)提取次数的确定。在最佳提取工艺条件下,取1份锁阳粉末,反复提取至检测不出熊果酸,测定锁阳熊果酸的含量,考察提取次数对熊果酸提取量的影响。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1熊乳酸/乙醇溶液相互作用由图2可见,随着乙醇体积分数增大,熊果酸的提取量增加。原因可能是随着乙醇体积分数的增大,乙醇溶液的极性也逐步减弱,而熊果酸属于五环三萜类非极性物质,根据相似相溶原理,熊果酸易溶于纯的乙醇溶液中。由于乙醇体积分数达到75%后,熊果酸提取量增加较小,考虑到成本问题,选择乙醇体积分数为65%~85%较为适宜。2.1.2温度对熊乳酸分散液的影响由图3可见,随着提取温度的升高,熊果酸提取量增加。曲线呈上升趋势的原因是,随着温度的升高,分子的运动速度加快,这有利于熊果酸从锁阳粉末中溶出并分散到溶液中。当温度升高到75℃以后,曲线上升缓慢,因此将提取温度控制在65~85℃较好。2.1.3熊乳酸提取量由图4可见,随着提取时间的延长,熊果酸提取量先上升后下降。原因可能是提取时间过短,熊果酸不能及时充分地释放到溶剂中,随着提取时间延长表现为提取量增加;当提取量达到最大值后,随着提取时间的延长,除了熊果酸以外的其他醇溶性物质的释放量也在继续增加,与熊果酸竞争溶剂,导致熊果酸提取量下降。因此,熊果酸的提取时间为1~2h较为适宜。2.1.4溶剂用量对锁阳熊羧酸提取量的影响一般而言,液料比是传质推动力的直接体现,随着液料比的增加,传质推动力增大,整个溶媒的传质过程加快。由图5可见,随着溶剂用量增加,锁阳熊果酸的提取量先增加后减少,原因可能是,随着溶剂用量增加,溶质的释放量增加,液料比达到15∶1(mL∶g)以后,熊果酸以外的其他醇溶性溶质在溶剂中所占比例加大,导致熊果酸量减少。因此,从节省溶剂和保证提取量的角度综合考虑,选择液料比为12∶1~18∶1较好。2.2反应试验结果2.2.1熊乳酸提取工艺条件对最佳条件的预测以熊果酸的提取量为响应值,在提取1次的基础上,以乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比为自变量设计4因素3水平的响应面分析试验(表1和表2)。采用软件DesignExpert8.0.7.1对表2中数据进行处理,得到回归方程:Y=5.37+0.2158X1+0.1433X2-0.0225X3+0.0033X4+0.02X1X2+0.0175X1X3+0.005X1X4+0.0075X2X3-0.0125X2X4-0.0725X3X4-0.2454X12-0.1617X22-0.1729X32-0.1767X42。由表3可知,模型的P<0.0001,模型是极显著的;失拟误差的P>0.05,表现为不显著;R2=0.9824,说明响应值的变化有98.24%来源于所选变量。因此,该模型拟合程度较好,可以用此模型来分析和预测熊果酸提取工艺条件。X1、X2、X3X4、X12、X22、X32、X42对熊果酸提取量的影响显著,其他项不显著,因此各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系;各因素对熊果酸提取量的影响大小顺序:乙醇体积分数>提取温度>提取时间>液料比。2.2.2交互作用分析响应面的陡缓程度可以反映出交互效应的强弱。响应面比较陡表示两因素交互作用显著,响应面比较缓表示交互作用不显著。由图6可见,X3X4交互作用显著,各因素对熊果酸提取量影响的大小顺序为X1>X2>X3>X4,与方差分析结果一致。2.2.3熊乳酸提取量的预测值回归模型预测的熊果酸提取工艺条件:乙醇体积分数79.7%、提取温度78℃、提取时间1.6h、液料比13.6∶1(mL∶g),熊果酸提取量的预测值为5.4mg/g。考虑提取条件的可操作性,将工艺条件修改为乙醇体积分数80%、提取温度78℃、提取时间1.6h、液料比14∶1,进行3次验证试验,熊果酸的提取量为5.38mg/g,预测值和实际值之间的误差0.37%,证明了响应面法优化熊果酸提取工艺的可行性。2.3锁阳样品中熊《果粉》含量的测定由图7可见,随着提取次数的增加,锁阳残渣中熊果酸的残留量越来越少,提取至第5次时,已经检测不到熊果酸。由此得出,锁阳样品中熊果酸的含量为6.58mg/g。每次提取出来的熊果酸占总量的比例分别为81.76%、15.96%、2.13%、0.15%、0,提取2次的总提取量为6.43mg/g,总提取率达到97.72%,此时锁阳中的熊果酸大部分被提取出来,从节省溶剂和后期浓缩纯化角度考虑,提取次数确定为2次。3提取工艺的研究本研究利用DesignExpert8.0.7.1软件对影响锁阳熊果酸乙醇回流提取工艺的各个因素进行了考察。结果表明,各因素对熊果酸提取量的影响大小顺序为乙醇体积分数>提取温度>提取时间>液料比;各因素的最佳值:乙醇体积分数80%、提取温度78℃、提取时间1.6h、液料比14∶1、提取2次,此条件下,锁阳熊果酸的提取量为6.43mg/g,提取率为97.72%。熊果酸是锁阳的有效成分,目前关于锁阳熊果酸的提取工艺研究报道有超声波法、索氏提取法,而关于锁阳熊果酸的乙醇回流提取工艺研究未见报道。参照文献[13,22]的提取方法,对取自甘肃敦煌的锁阳进行熊果酸提取,