GB 4789.13-2012 产气荚膜梭状芽孢杆菌检验 好

国家食品安全标准Nationalfoodsafetystandard微生物学检验Foodmicrobiologicalexamination产气荚膜梭菌检验ExaminationofClostridiumperfringens赵广英

GBT4789.13-2012

Clostridiumperfringensx10,000

/cmspweb/datav1/im080014.htm

本节主要内容：

产气荚膜梭状芽孢杆菌的生物学特性和检验程序及对检验程序的解释。

目录第一部分：基础知识1.概述2.生物学特性3.毒素与分型第二部分：国标/bacteriology/archives/2004/09/uuoeoeoeuoeuuu.html

第一部分：基础知识1、概述

产气荚膜梭状芽孢杆菌又称魏/卫氏梭菌分布：自然界广泛存在。易污染食品：动物性食品原料食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量繁殖，菌数可达数十万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及证实试验。2、生物学特性1)形态与染色

G+无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为(1－2)μmX(2－10)μm。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。Clostridiumperfringens/research/micimm/index.php

www.uni-ulm.de/klinik/imi/mikrobio_2002/krankenversorgung/Diagnostik/Erreger/c_keim.htm2)培养特性*不严格的厌氧*普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。

*适宜生长温度为37—47℃。*生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。*在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h传种1次，较易分离纯化。

深层葡萄糖琼脂培养：－－大量产气，致使琼脂破碎；牛奶培养基中生长：－－45度下2h可见到激烈发酵：庖肉培养基中培养：－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化。普通琼脂平板上培养：－－15h－24h形成S型菌落，在营养不足或琼脂浓度高的平板上可形成R型菌落。

/course/fsc/441/resulex10.htmlat45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation

。鲜血琼脂平板生长：

－－菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特征之一。

ClostridiumperfringensbacteriaonabloodagarplateCourtesyGlennSonger,The

University.ofArizonaCollegeofAgricultureandLifeSciences.

：/articles/01_02/Clostridium_seq.shtmlClostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbenchwww.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.htmlClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar/articles/01_02/Clostridium_seq.shtmlwww.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.html

菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的α抗毒素抑制。

*由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化

*本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。www.sat.affrc.go.jp/joseki/Anaerobes/Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养新版本不用了3)生化特性

*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，*液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。/aaa/micro.html4）抵抗力

A型与C型菌株的芽胞：耐热性强，煮沸1－3h，繁殖型菌体不耐热。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html3、毒素与分型

毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。

外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。还有透明质酸酶等酶类。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。

分型：

根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C，D，E和F六个型。

A型：最常见，引起气性坏疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分离，所以叫卫氏/魏氏梭菌

C型：可引起肠炎。

*对人致病的主要是A、C和F型

*引起食物中毒的主要是A型

1.前言本标准代替GB/T4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》本标准与GB/T4789.13—2003相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了样品制备过程；——修改了培养基与试剂；——修改了操作步骤；——修改了菌数计算部分；——增加了附录A。2.范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。3.培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。A.1.1基础成分胰胨15.0g大豆胨5.0g酵母粉5.0g焦亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁铵1.0g琼脂15.0g蒸馏水900.0mLA.1.2D-环丝氨酸溶液1gD-环丝氨酸于200mL临用前每250mL基础溶液中加入20mLD-环丝氨酸溶液碳源、氮源、维生素和生长因子检测硫化氢，＋：菌落中心呈黑色抑制非梭菌细菌；加热灭菌失活，过滤除菌，用前加

3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。

－－大量培养该菌用

胰蛋白胨15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g蒸馏水1000.0mLpH7.1±0.2有效降低氧化还原电位，防止过氧化物的积累对菌体产生的毒害；同时硫氢基团有钝化含砷、汞及其它含重金属防腐剂的抑菌作用少量琼脂可以防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散，氧化还原指示剂，氧化态粉红色，还原态无色注意：临用时粉红色超过1/3时，水浴加热至无色再用，如全管呈粉红色时，不宜再用。

3.3动力—硝酸盐培养基：见附录A中A.3。

--无鞭毛，不运动；还原硝酸盐为亚硝酸盐:+3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4明胶液化试验--乳糖发酵+由红变黄；明胶液化+

3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5

/course/fsc/441/resulex10.html--发酵牛奶中的乳糖，产酸，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓“暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h，5h不发酵为阴性3.60.1％蛋白胨水稀释剂：见附录A中A.54.7革兰氏染色液。G-3.8硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液：在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与α－萘胺偶合形成紫红色。3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。46℃,2～5h爆发酵36℃，24h，动力—；硝酸盐还原＋：变红胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂液体硫乙醇酸盐培养基4.6.结果与报告选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。式中：

T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；

A——单个平板上典型菌落数；B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；

C——单个平板上用于确证试验的菌落数；n1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；0.1——稀释系数；d——稀释因子（第一稀释度）T=∑(A——)BC(n1

+0.1n2)d报告根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中公式计算，报告每g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。复习思考题1、食品中产气荚膜