临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展

临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展

主要学习内容要求基本概念细菌的耐药性检测临床常见的耐药菌株掌握

IFI的实验诊断方法及临床意义熟悉了解标本的采集方法返回上一页下一页本章主要学习内容和要求

第一节概述一、现代感染性疾病的特点（一）一般实验室检查1.血常规检查2.C反应蛋白(CRP)3.降钙素原(PCT),是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标.（二）病原学实验诊断感染性疾病的病原体的实验诊断方法包括病原体的分离培养、病原体特异性抗原抗体的检测、病原体核酸检测等多种方法。二、感染性疾病的实验诊断方法第二节细菌感染的实验诊断一、标本的采集与培养方法（一）标本采集原则：1.采集标本时应无菌操作。2.应选择感染部位或病变明显的部位采集标本。3.选择在最佳时间采集适宜标本。4.尽量在抗生素使用前采集。5.标本采集后应及时送检。（二）常用标本的采集及培养方法血液脑脊液与其他无菌体液尿液呼吸道标本粪便泌尿生殖道标本创伤、组织和脓肿标本二.细菌感染的常用病原学检测

直接显微镜检查病原体分离、培养和鉴定病原体抗原检测病原体核酸检测病原体抗体检测细菌毒素检测直接显微镜检查

TheGramStainTheGramStainCryptococcusneoformans(indiainkstain)ThecapsuleoftheyeastresistscolorizationbytheIndiaink,resultinginclearorganismsagainstdarkbackgroundM.Tuberculosis(acidfaststain)病原体分离、培养和鉴定MediaBloodagarSelectionmediaMacconkey’sagar鉴定程序菌落形态革兰染色生化特性S.pneumoniaethemostcommoncauseofbacterialpneumonia;attackspatientswithweakenedrespiratorydefenses;oxidase124第三节细菌的耐药性检测一、细菌耐药性的概念细菌耐药性(drugresistance):是指细菌对某抗菌药物的相对抵抗性。指病原体对反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消失的现象。第三节细菌的耐药性检测二、细菌耐药性的遗传机制

天然耐药性与抗菌药物无关，是细菌固有的，在某种抗菌药物发现或产生之前所分离的细菌已对该药已具有耐药性。获得性耐药A染色体介导的耐药—

突变B质粒介导的耐药—

转导、转化、接合、易位细菌耐药性

染色体染色体耐药性

-稳定

-垂直传播

-无水平传播

(耐药性不会从一种细菌传给另一种细菌)

细菌耐药性

质粒质粒的耐药性不稳定,由于抗生素的使用选择了耐药质粒-耐药基因由一个细菌传给另一个细菌,甚至是不同的细菌细菌产生耐药的因素

人的行为使微生物—

适应生存，产生新的防御力抗菌药物是医院中各类药物使用范围最广；使用频度最高；使用量最大的药物

抗菌药物的大量使用和不合理使用使微生物产生耐药性

多重耐药菌在全世界播散，使抗微生物化疗失去效力，以致我们的治疗可能又回到了抗菌药物诞生之前的时代ScreeneddrugresistantstrainbySelectivepressure第三节细菌的耐药性检测三、抗生素的耐药机制膜通透性的降低改变作用靶位分泌各种酶主动外排第三节细菌的耐药性检测五、抗生素敏感试验（一）概念最小抑菌浓度（MICminimalinhibitoryconcentration）:能够抑制细菌生长的最小抗生素浓度。最小杀菌浓度（MBCminimalbactericidalconcentration）能够杀死99.9%的细菌的最小抗生素浓度。（二）试验方法DilutionSusceptibilityTestsBrothdilutionAgardilutionAutomatedbrothmicrodilutionDiskdiffusionEtestScreeningPlatesMolecular(latexagglutination,NAAT)LaboratorystandardsNCCLS(changedtoCLSIinJan2005)AntibacterialAntibioticsβ-lactamantibioticsPenicillinCephalosporinsMonobactamsCarbapenemsOthersGlycopeptideAminoglycosideMacrolidesClindamycinTetracyclineQuinoloneTrimethoprim-sulfamethoxazoleMetronidazole常用抗菌药物的选择与分组BrothdilutiontestTubedilutiontestfordeterminingtheminimuminhibitoryconcentration(MIC).AgarDilutionPenicillin1mg/L2mg/L4mg/LMIC=4mg/LBrothMicrodilutionTestingBrothMicrodilutionTestingDiskdiffusiontestE-testanddiskdiffusion药敏试验结果的表示及临床意义SIRBreakpointMICbreakpointsbasedonstudiesassessing:–PK/PDbasedonsystemicantibioticdelivery–Clinicalefficacystudies»Clinicalresistancevs.biologicresistance第三节细菌的耐药性检测六、临床常见的耐药菌株耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）耐青霉素的肺炎链球菌耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的金黄色葡萄球菌产ESBLs的革兰氏阴性杆菌高产AmpC酶的革兰氏阴性杆菌泛耐药的铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌产NDM-1的超级细菌金黄色葡萄球菌青霉素耐药金葡菌甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)mecAPenicillinMethicillin万古霉素耐药屎肠球菌(VRE)vanA万古霉素（糖肽类）中介/耐药金葡菌（VISA、GISA）万古霉素耐药金葡菌（VRSA）Vancomycin[1940][1960s][1990s][1996][2002]葡萄球菌耐药性发展历程抗感染治疗什么是MRSA?耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌1961年英国首次报道1968年美国报道MRSA的发生率

40ThICAAC5大洲33个国家的调查

2%-80%中日联谊医院金黄色葡萄球菌的分离趋势MRSA的危害致病性强 临床常见的病原菌及引起院内感染的重要致病菌.治疗手段单一传染性 常引起暴发的集团感染MRSA的传播存在于健康人的皮肤,鼻咽等部位.机体免疫力低下及各种插管诊断治疗时引起感染通过与他人接触引起感染MRSA的耐药机制作用靶位发生改变

mec-A基因------PBP2aMRSA的耐药特性对所有β内酰胺类药物均耐药(包括青霉素,头孢菌素,碳青霉烯类)MRSA的检测常规的纸片扩散法oxacillin6ug/ml平板筛选法PCR法检测MecA基因MRSA治疗万古霉素替考拉宁利奈唑胺Vancomycin-ResistantStaphylococcusaureus

VISA,Japan,1996,MIC8ug/ml2002年6月前，美国8株VISA。2002年6月，第一株VRSA，美国Michigan重要的革兰阴性耐药菌肠杆菌属产ESBLs的肠杆菌产碳青霉烯酶的肠杆菌非发酵菌多重耐药铜绿假单胞菌多重耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶ESBLs基本概念及耐药性特点K.pneumoniae和E..coli由Tem-1，Tem-2，SHV-1编码β内酰胺酶的基因突变而来，由质粒介导，并传播。体外对三代头孢菌素和氨曲南抑菌环减小。加克拉维酸抑菌环扩大。对所有的青霉素类，头孢菌素及氨曲南耐药。对碳氢酶烯类（泰能）、头霉素类（头孢西丁）及克拉维酸敏感。ESBLs 历史1983年德国首次报道产ESBL的臭鼻克雷伯菌Shv-21985年法国暴发流行产ESBL的肺炎克雷伯菌随后，德国，英国等国家相继暴发流行产ESBL的肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌。ESBLs的检测纸片扩散法MIC法双纸片协同法2013中日4658株病原菌分布中日分离大肠埃希菌耐药率（680株）中日肺炎克雷伯菌耐药率（596株）中日铜绿假单胞菌耐药率（458株）中日金黄色葡萄球菌耐药率（330株）中日鲍曼不动杆菌耐药率（301株）选择抗感染治疗方案时应该考虑的因素经验治疗感染的类型可能的病原菌当地细菌感染的流行病学资料药效学目标治疗明确了病源菌获得了抗生素敏感性实验结果应用PK/PD参数，制定合理的治疗方案考虑病人生理和病理生理状态其它因素评估病原体评估耐药性应用PK/PD理论合理优化抗感染治疗方案TimekillcurvesforPseudomonasaeruginosaATCC27853withexposuretotobramycin,ciprofloxacin,andticarcillinatconcentrationsfromonefourthto64timestheminimuminhibitoryconcentration.(FromCraigWA,EbertSC.Killingandregrowthofbacteriainvitro:Areview.ScandJInfectDis.1991;74:63–70.)

AntimicrobialPK+MIC+Outcome‘（μg/mL）CmaxMICTimeabove

MICCmax/

MICratio24hAUC/

MICratioAUCMIC=minimuminhibitoryconcentrationAUC=areaundertheconcentrationcurvePK

/PD参数Time>

MIC/用药间隔24824ｈｏｕｒ16细菌数量

不合理的给药次数对治疗的影响‘（μg/mL）MIC24824ｈｏｕｒ16细菌数量常用抗生素的PK/PD参数如何应用PK/PD参数优化治疗方案时间依赖性抗生素可通过增加给药次数、延长点滴时间甚至持续给药以达到治疗目标靶值。浓度依赖性抗生素可通过提高血药浓度已达到目标靶值。如何应对这些耐药细菌？抗生素的合理应用原则只能用于治疗感染性疾病尽早确立病原菌诊断针对性经验治疗结合临床评价细菌培养与药敏结果的意义选用作用强，在感染部位浓度高的抗生素要有合理的治疗终点或疗程要重视必要的综合治疗指征明确才能联合使用抗生素抗生素的联合应用目的：

产生“协同”或“相加”，减少患者不良反应，减少细菌耐药性。适宜的种类：繁殖期杀菌剂（β-内酰胺类）与静止期杀菌剂（氨基糖苷类）。

β-内酰胺类+大环内酯类？抗生素的联合应用能够提高初始治疗的准确率，从而增加疗效。MRSA治疗万古霉素VISAVRSAhVISAVancomycinMICcreep利奈唑胺耐药？适应症替加环素产ESBLs的肠杆菌的治疗碳青霉烯类抗生素含酶抑制剂的

内酰胺类抗生素其他碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌治疗

含酶抑制剂的

内酰胺类抗生素氨基糖苷类喹诺酮类头孢他啶、头孢吡肟联合碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌的治疗

含舒巴坦的

内酰胺类抗生素替加环素氨基糖苷类喹诺酮类联合第四节侵袭性真菌病的实验诊断一、真菌感染的类型

浅表真菌病皮下真菌病全身性或侵袭性真菌感染医学真菌分类医学真菌酵母菌霉菌皮肤癣菌双相真菌重要医学酵母菌分类条件致病酵母菌念珠菌属非念珠菌属白念珠菌非白念珠菌隐球菌属毛孢子菌属克柔念珠菌光滑念珠菌其它念珠菌热带念珠菌近平滑念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌酵母属红酵母属酵母属红酵母属医学重要的霉菌分类霉菌曲霉属非曲霉属烟曲霉非烟曲霉黄曲霉黑曲霉土曲霉构巢曲霉镰刀菌属暗色孢霉赛多孢属接合菌链格孢霉属双极菌属万氏霉属弯孢属茄病镰刀菌尖孢镰刀菌尖端赛多孢多育赛多孢根霉属毛霉属根毛霉属梨头霉属小克银汉霉属烟曲霉黄曲霉黑曲霉土曲霉构巢曲霉侵袭性真菌感染的高危人群侵袭性真菌感染高危因素念珠菌感染*1曲霉感染*2严重粒细胞缺乏免疫功能低下移植入住ICU住院时间延长糖尿病肾功能衰竭血液透析使用广谱抗生素中心静脉插管严重粒细胞缺乏免疫功能低下实体器官移植入住ICU血液肿瘤骨髓移植长期应用激素治疗慢性阻塞性肺病(COPD)*念珠菌感染高危因素还包括：胃肠外营养、使用免疫抑制剂、肿瘤和化疗、急性重症胰腺炎、多部位念珠菌定植、外科手术等；曲霉感染高危因素还包括：实体器官肿瘤、HIV感染、重度烧伤、免疫抑制剂治疗、营养不良等。1、Sotrosky-ZeichnerLetal.CritCareMed.2006;34:857-863.2、MeerssemanWetal.ClinInfectDis.2007;45:205-16.中性粒细胞缺乏易导致患者发生侵袭性真菌感染(25/82)(57/82)尸检检出真菌感染的患者中，严重中性粒细胞减少患者占70%一项三级肿瘤监护中心1989年至2003年期间1017例血液肿瘤患者的尸检结果，其中314例患者发生生侵袭性真菌感染。上图为1999年至2003年的数据。3、ChamilosGetal.Haematological.2006;91:986-989.曲霉病诊断症状体征—特异性？影像学—特异性？真菌涂片—特异！敏感性？真菌培养—敏感性？特异性？时间3~5d病理—特异！敏感性？有创早期、快速、敏感、特异、无创2008年IDSA曲霉病治疗指南指出

多种方法用于诊断曲霉感染诊断方法特点优势劣势培养可明确区分曲霉和其它丝状真菌血培养作用有限，某些播散性感染常常为假阳性全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性细胞学检查、组织病理学检查可获取明确的曲霉病诊断证据需侵入性手段获取标本全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性CT检查晕轮征、空气-新月征等有助于早期诊断其它某些真菌或细菌感染也有可能出现相似征象在免疫正常宿主相关研究较少GM试验是诊断侵袭性曲霉病的替代指标是建立早期诊断的有效辅助检查，尤其适用于存在高危因素患者的筛查时有一定假阳性G试验可早期检出侵袭性真菌感染对曲霉不具特异性有一定假阳性PCR检测有较好的前景目前方法尚未标准化，尚在研究阶段联合GM检测与CT检查提高侵袭性肺曲霉病的检出率可提示早期开始抗真菌治疗的时机——14、WalshTJetal.ClinInfectDis.2008;46:327-60.侵袭性真菌感染的实验室检查(1→3)-β-d-葡聚糖：G试验曲霉半乳甘露聚糖：GM试验GM可作为IFI早期诊断的指标GMsensitivity90.6%(48/53)Beforeradiologicsigns64.6%(31/48),−8.4days.Beforeclinicalsymptoms39.6%(18/48),−6.9days.GMspecificityof94%(700/744）AnnieSulahian,etal.CANCER,2001,91:311JID2004:190641GM可否作为疗效评估的指标？JID2004:190641GM与预后PenackO,etal.AnnalsofOncology.2008,19:984.GM试验假阳性抗菌药物：哌拉西林-三唑巴坦采样：用药前，或在血药浓度较低时高剂量使用激素透析：不能清除大分子GM化疗的严重黏膜炎的患者谷类食物中的GM抗原通过肠道入血儿童和新生儿：假阳性83%母乳或配方食品中双歧杆菌与GM有交叉反应交叉反应真菌：青霉、拟青霉、隐球菌、头状地霉等Atotalof135serumsampleswerecollectedfrom15patients.Whenacut-offlevelof>0.7wasusedforGMpositivity,therewerenofalsepositiveresults.Whenacutofflevelof<0.5wasused,sixserumsampleswerepositive.TherewerenostatisticallysignificantdifferencesbetweenthemedianGMindicesormedianBDGlevelsofthevarioussamplingtimes.Nosignificantinteractionwasobservedbetweenpiperacillin/tazobactamadministrationandAspergillusGMandBDGassays.GM试验假阴性抗真菌药物三唑类－降低GM水平但：棘白菌素类－升高GM水平（能够破坏真菌细胞壁，但不能清除）低侵袭性曲霉病低曲霉负荷量G试验底物：(1→3)-β-D-葡聚糖真菌细胞壁成分念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀菌、支顶孢属、卡氏肺孢子菌除外隐球菌、结合菌纲真菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）高特异性、高NPVG试验Usingacut-offof20pgml,37of41episodesofprovenfungalinfectionshadpositiveresults(sensitivityof90%)andallof59episodesofnon-fungalorigintestednegative(specificityof100%).Of456autopsies,54(11.8%)IFIleukemias:28cases[52%]malignantlymphomas:7[13%]acquiredimmunodeficiencysyndrome:7[13%]solidmalignancies:6[11%]andautoimmunediseases:6[11%]Aspergillusspecies:38cases[70%],Pneumocystisjiroveci:7[13%]Candidaspecies:4[7%]Cryptococcusneoformans:3[6%]Tricho