绿色木霉代谢抑菌物质稳定性研究

绿色木霉代谢抑菌物质稳定性研究

微生物发酵产生的抗菌素，在季节、地区和气候的影响下易于大规模生产，近年来引起了人们的关注。微生物的培养基大多来源广、价格低廉,所以微生物抗菌素成本较低,来源天然,具有较大的发展潜力。木霉菌(Trichoderma)属于半知菌亚门,丝孢纲,丝孢目,粘孢菌类,是一类资源丰富的真菌。可产生挥发或不挥发性的抗生素类物质,如木霉菌素(trichodermin)、胶毒素(gliotoxin)、胶绿木霉素(glioviridin)、绿色菌素(viridin)和抗菌肽(antibioticpeptide)以及挥发性抗菌素。绿色木霉菌(T.viride)能分泌具很强的降解结晶纤维素能力的代谢产物;产生拮抗其他微生物的次生代谢产物;可以产生水溶性稳定的黄色素。试验对绿色木霉代谢抑菌物质的稳定性进行了全面的研究,包括其热稳定性、酸碱稳定性、光稳定性、耐贮藏性、微波稳定性以及金属离子、防腐剂、氧化剂、还原剂对其的影响。1材料和方法1.1灰黄青霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、黑曲霉、结培训菌、表1.绿色木霉(Trichodermaviride),荔枝炭疽菌(Colletotrichumgloeos),尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum),灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum),芒果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides),根霉(Rhizopus),黑曲霉(Aspergillusniger)。由华南农业大学提供。1.2cucl2、fecl3的分析纯试剂:琼脂,生化试剂;葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、FeCl2、FeCl3均为分析纯。仪器:DHZ-DA型冷冻恒温振荡器:江苏太仓市实验设备厂;DHP-90系列不锈钢胆电热恒温培养箱:上海索谱仪器有限公司;pHS-25型酸度计:上海伟业仪器厂。1.3培养基和培养菌种活化:将PDA培养基分装规格于(13×130)mm的试管中,制成斜面长度为10cm的固体培养基,划绿色木霉划线接种后于28OC培养箱中培养5d。液体培养基:土豆20%、葡萄糖2%、硝酸钾0.04%,pH为9。液体培养:用接种环将斜面培养的绿色木霉孢子刮下,用10mL无菌水冲洗至三角瓶中制成菌悬液。按1.5%的接种量将菌悬液接种于含有60mL液体培养基的三角瓶中(250mL)中,在32.5℃,125r/min发酵4d。1.4发酵溶液处理液体培养4d后,用滤纸粗滤除去菌丝,再用0.22μm的微孔滤膜除去孢子,于4OC冰箱中保存备用。1.5菌种空白、平行试验在超净工作台里,将发酵液和培养基按1∶10的比例混合,摇晃均匀,倒平板(直径9cm),每个灭菌培养皿倒入(15~20)mL混合培养基,待培养基凝固后接菌于培养基中心,置于30OC恒温培养箱中倒置培养5d左右。每种菌设置3个空白及3个平行试验。(3~5)d测量其菌落的大小,计算抑菌率。1.6发酵溶液稳定性的测定1.6.1可靠性将发酵液分别于不同温度恒温水浴锅中处理1h后,测其抑菌率。以未处理发酵液和无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.2碱性稳定性分别用1mol/LNaOH和1mol/LHC1将发酵液调至pH值为3~10,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.3光稳定性将发酵液置于25℃下自然光下贮藏不同天数后,测其抑菌率。以置于暗处处理的发酵液和无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.4耐贮藏性将发酵液置于4℃冰箱中贮存不同天数后,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.5微波加热对发泡液稳定性的影响将发酵液分别置于微波炉中加热不同时间后,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.6阳离子液体发酵对抑菌率的影响用已灭菌的去离子水分别配制浓度为0.1mol/L的K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+的离子溶液,各取1mL分别放入9mL发酵液里,4℃下放置15h,测其抑菌率。以未处理的发酵液和无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.7防腐剂对发泡剂稳定性的影响分别配制不同浓度的苯甲酸钠溶液,各取1mL分别放入9mL的发酵液里,放置15h,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.8添加剂对发泡剂稳定性的影响分别配制不同浓度的H2O2,各取1mL分别放入9mL的发酵液里,放置15h,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。1.6.9原料还原剂对发泡剂稳定性的影响分别配制不同浓度的亚硫酸钠溶液,各取1mL分别放入9mL的发酵液里,放置15h,测其抑菌率。以无菌水为对照,每个处理重复3次。2结果与分析2.1两种炭疽菌的抑制作用图1表明,绿色木霉的代谢物有较高的抑菌活性,其中对芒果炭疽菌的抑制作用最强,达到72.18%;其次是荔枝炭疽菌和尖包镰刀菌,均超过50%;对青霉菌的抑制作用稍弱。2.2发酵溶液的稳定性2.2.1可靠性图2表明,绿色木霉代谢产物代谢产物对温度有一定的敏感性,但在40~80℃范围内仅下降5%左右;在50~80℃的范围内几乎无变化。2.2.2碱性稳定性图3表明,绿色木霉发酵液在pH6~7的环境中稳定,在酸性、碱性条件下均不稳定。2.2.3光稳定性图4表明,常温条件,在考察期的64d内,抑菌率总体呈下降趋势;光因素并未对绿色木霉发酵液造成较大影响,在5%的范围内。2.2.4耐贮藏性图5表明,绿色木霉发酵液有较好的耐贮藏性,在40d内抑菌率仍然可保持在50%以上。2.2.5微波加热对发泡液稳定性的影响图6表明,微波加热对绿色木霉发酵液的影响不大,300s内抑菌率下降仅有6%左右。2.2.6不同菌株对绿色木霉发酵液的影响图7表明,在考察的几种金属离子中,绿色木霉发酵液除了受Cu2+、Fe3+的影响稍大,下降了8%~15%左右;对其他金属离子具有较好的稳定性。2.2.7对炭疽菌、尖包施工及稳定性的影响图8表明,随着苯甲酸钠浓度的增大,对于荔枝炭疽菌的抑制率呈下降趋势,而对于尖包镰刀菌的抑制率则呈现波动,苯甲酸钠对其稳定性会造成一定的影响。2.2.8添加剂对发泡剂稳定性的影响图9表明:H2O2的浓度在0.5%以下时,绿色木霉发酵液具有较高的稳定性,大于1.0%时下降幅度开始增大。2.2.9原料还原剂对发泡剂稳定性的影响图10表明,随着亚硫酸钠浓度的增大,抑菌率逐渐下降,浓度在0.04mol/L以下,绿色木霉发