发酵米粉中微生物的分离纯化及鉴定

发酵米粉中微生物的分离纯化及鉴定

以水稻为原料，通过自然发酵生产的发酵粉末，口感清新、光滑、弹性，品质优于无发酵粉末。但是,由于目前发酵米粉的生产基本上是手工作坊式的,生产规模小,产品质量不稳定。要对其进行大规模生产,实现产业化,通过人工模拟自然发酵的过程,是一种可行的方法。要模拟自然发酵的过程,就必须先弄清楚在发酵过程中起作用的微生物以及这些微生物的特性。国内对粉条生产相关的微生物报道较少。1980年,北京大学生物系与北京粉丝厂合作对绿豆粉丝生产的酸浆法进行了研究。研究发现,酸浆法是乳酸菌产生的淀粉凝集素起到沉淀淀粉的作用,该凝集素可将淀粉凝集成块状,加速淀粉的沉淀而使之有效地与蛋白等成分分离。其后再没有更深入的研究。秦礼康等人将绿豆粉丝生产的酸浆法应用于马铃薯淀粉的生产。结果发现淀粉沉淀时间缩短了6倍,30min内淀粉收率增加31.1%,淀粉白度提高16.6%,劣质淀粉比例减少10.9%。施安辉等人对贵州等地引起腐败的微生物进行了分离研究。结果表明,引起腐败的微生物主要是芽孢杆菌(包括枯草芽孢杆菌、醋酸芽孢杆菌和马铃薯芽孢杆菌等),无芽孢杆菌(主要是乳酸杆菌和乳酸链球菌),酵母菌和霉菌等。因此,本文第一次系统地对发酵米粉发酵过程中的主要微生物进行了分离纯化并用试剂盒对其进行了鉴定。为进一步研究发酵米粉的发酵机理提供前提条件。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验材料发酵米粉由常德发酵米粉厂提供。选取了三家不同工厂的不同发酵阶段(原料米、浸泡3h、发酵24h、发酵48h、发酵72h等)样品。1.1.2材料和培养基培养基:MRS肉汤培养基(BectonDicknson,USA);M17肉汤培养基(BectonDicknson,USA);DRBC琼脂培养基(Oxoid,England);琼脂粉。仪器设备:恒温培养箱,真空泵,真空罐,电子天平,无菌操作台,灭菌锅,显微镜等。1.1.3iii50chl鉴定系统试剂:过氧化氢,革兰氏染色试剂。试剂盒:API50CHL鉴定系统,API20STREP鉴定系统,ID32CAPI鉴定系统。软件:APILABPlusV3.3.3。1.2方法1.2.1分离纯度方法1.2.1.u3000制备导电材料称取MRS肉汤培养基28.5g、琼脂粉7.5g于500mL三角瓶中,加入500mL蒸馏水,搅拌均匀并用电炉加热至固体完全溶解,封口,121℃灭菌15min。室温冷却至50℃倒平板及试管,待冷却凝固后以划线法接种,37℃真空罐中恒温培养72±3hr,镜检后,挑取形态不同的单菌落转接5次,所得菌种穿刺接种于试管培养基于4℃冰箱保藏。1.2.1.搅拌、冷却称取M17肉汤培养基24.2g、琼脂粉7.5g于500mL三角瓶中,加入475mL蒸馏水,搅拌均匀并用电炉加热至固体完全溶解,封口,121℃灭菌15min。室温冷却至50℃加入25mL10%灭菌后的乳糖,倒平板及试管,待冷却凝固后以划线法接种,37℃真空罐中恒温培养(72±3)h,镜检后,挑取形态不同的单菌落转接5次,所得菌种穿刺接种于试管培养基于4℃冰箱保藏。1.2.1.搅拌、冷却称取DRBC琼脂培养基15.75g于500mL三角瓶中,加入500mL蒸馏水,搅拌均匀并用电炉加热至固体完全溶解,封口,121℃灭菌15min。室温冷却至50℃倒平板及试管斜面,待冷却凝固后以划线法接种,28℃恒温培养72±3h,镜检后,挑取形态不同的单菌落转接5次,所得菌种接于斜面试管培养基于4℃冰箱保藏。1.2.1.4个显微镜检查分离纯化后的乳酸杆菌、乳酸链球菌、酵母菌用显微镜观察其生理形态,从形态学上初步确定其微生物种类。1.2.2鉴定方法1.2.2.过氧化氢酶的产生在干净的载玻片上滴一滴9%的过氧化氢,挑取一小环分离纯化得到的菌种涂布于过氧化氢溶液中,30s后观察是否有气泡产生,有气泡产生者为过氧化氢酶阳性,无气泡产生者则为过氧化氢酶阴性。将分离纯化得到的乳酸杆菌和乳酸链球菌一一进行革兰氏染色,分出革兰氏阴性菌和阳性菌。1.2.2.酵母菌的鉴定选用过氧化氢酶试验阴性且革兰氏染色为阳性的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用API50CHL鉴定系统,API20STREP鉴定系统进行鉴定,将分离纯化的酵母菌用ID32CAPI鉴定系统进行鉴定。将鉴定结果记录于试剂盒记录单。1.2.2.4.软件分析将上一步所得的试验记录用相应的软件系统进行分析,得到鉴定结果。2酵母菌在米粉发酵中的应用经分离纯化、镜检以及乳酸菌的过氧化氢酶实验和革兰氏染色后的得到37株乳酸杆菌,17株乳酸链球菌,27株酵母菌,分析鉴定后结果统计于下表。由上列表格可以看出,从发酵米粉中分离纯化得到的发酵微生物是以胚芽乳杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母为优势菌株的乳酸杆菌、乳酸链球菌、酵母菌三类。我们的相关研究表明,发酵米粉浸泡液中的乳酸杆菌、乳酸链球菌、酵母菌的数量分别为:(8.13±0.10)logcfuml-1、(2.69±0.34)logcfuml-1、(7.95±0.16)logcfuml-1,它们是米粉发酵中的主导微生物。而且在其他的一些发酵食品中也应用到这些微生物。胚芽乳杆菌等乳酸杆菌应用在香肠加工、发酵饲料的生产以及一些下脚料的乳酸发酵中,是具有优良发酵特性的乳酸菌。因而在发酵工艺的控制中应该充分发挥该菌的优势,使其在最大程度上改善米粉的品质。而屎肠球菌、浅绿气球菌等乳酸链球菌多为致病菌,可导致菌血症、新生儿败血症等,而且大多抗药性很强。该菌主要在其中一家工厂的发酵样中分离得到,这与其生产加工环境有关。该厂家的生产环境以及浸泡池卫生条件不够好,采样时发现发酵池表面有异常的泡沫并有不良气味。因此,在工业生产中控制这些致病菌的生长繁殖是防止产品微生物危害的一个重要方面。酿酒酵母等酵母菌含有丰富的α-淀粉酶和糖化酶等,发酵过程中降解淀粉,产生多糖,是发酵米粉品质优于不发酵米粉的原因之一。酵母菌具有丰富的酶系,其酯酶、类脂酯酶、类脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶等的活性都很强。可能是发酵过程中改良米粉质地的一个重要因素。3在其他食品发酵中的应用此次从发酵米粉中分离鉴定出的乳酸菌种类在国外其它发酵食品的研究中也有报道。胚芽乳杆菌能够利用淀粉产酸,Muyanja在研究一种非洲高梁发酵饮料bushera时发现胚芽乳杆菌是其发酵后期的优势菌。Kunene在研究高梁发酵食品时也从原料和熟制品中分离出胚芽乳杆菌。胚芽乳杆菌还是某些天然谷物制品发酵后期的优势菌株。胚芽乳杆菌还被应用在多种发酵蔬菜中。Mbugua指出,在发酵过程中添加纯种肠膜明串珠菌可通过其迅速酸化作用抑制革兰氏阴性菌,从而保证产品的风味稳定。德氏乳杆菌的生长具有嗜热的属性,通常能从较高温度的食品原料中分离得到。德氏乳杆菌用于南非啤酒mahewu的发酵,使mahewu的发酵时间由36h缩短到6h。鉴定表明,在发酵米粉中还有链球菌。肠球菌属(Enterococcus)分类学上属于链球菌科,是人类和温血动物肠道的正常栖居菌。既往曾认为肠球菌是对人类无害的共栖菌,但近年来的研究已证实了它的致病潜力。它在食品发酵中起的作用还有待进一步研究。在米粉发酵过程中,乳酸菌是主要优势菌,其次是酵母菌。乳酸菌和酵母菌在发酵过程中