植物抗线虫基因工程的分子标记

植物抗线虫基因工程的分子标记

植物线虫是植物的一个重要领域。根据美国科学家的统计，世界每年的损失可达1000亿美元。解决植物线虫危害的主要途径之一是培育抗线虫植物新品种。研究发现,自然界一些植物中存在抗线虫基因,如番茄、甜菜和小麦等,目前一部分抗线虫基因已被克隆,一部分不久将会被克隆和鉴定。标记和克隆这些基因,并在分子水平上对其进行遗传操作与以利用,能大大加速育种的进程,具有广阔的应用前景。1种植物的寄生虫严重危害植物的线虫类群较多,如根结线虫、胞囊线虫、滑刃线虫、茎线虫、粒线虫及短体(根腐)线虫等,而根结线虫(Meloidogynespp)和胞囊线虫(Heterodera和Globodera)是危害最严重的两大类。农业生产上危害最重的根结线虫有4个种,即南方根结线虫(Meloidogynincognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫(M.hapla)和花生根结线虫(M.arenaria)。它们的寄生范围很广,主要危害茄科、葫芦科、花生等多种植物。胞囊线虫是另一类危害较重的线虫,主要有大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、燕麦胞囊线虫(H.avenae)、马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)、马铃薯白囊线虫(G.pallida)。它们的共同点是都危害根系,造成根系衰弱,发育不良,甚至腐烂,导致地上部生长衰弱、矮化、叶片变黄、开花少,甚至全株枯死,严重危害农业生产。随着人们环保意识的加强,应用化学农药防治作物的线虫病愈来愈受到限制,提高作物自身的抗病性防治病害是一种既经济又有效的措施,倍受人们的关注。2抗线虫基因的分子标记、定位和克隆2.1抗作体体中的基因表达德国科学家对甜菜的抗病育种做出了巨大的贡献,尤其是在抗甜菜胞囊线虫(H.schachtiiSchm.)研究方面成绩显著。1992年,Jung等用抗线虫野生甜菜(Betapatellaris)和栽培品种进行杂交,对抗性基因进行了分子标记;采用染色体特异性质粒文库方法,建立一种高密度不连续RFLP植物基因组图谱。通过几年不断的努力,在1997年Cai等克隆出了第1个抗甜菜胞囊线虫基因-Hs1pro-1,通过特异基因组卫星标记和基因组断裂点分析进行克隆。相应的cDNA通过农杆菌介导和CaMV35s启动子控制下在甜菜根中进行了表达。在这种抗性品种中很少观察到线虫的雌虫。其对线虫的抗性主要表现为雌虫不能完成生活史,也不能产卵,被线虫取食的合胞体很小,与正常的合胞体明显不同。Hslpro-1基因在根中表达产物是282个氨基酸序列,不完全富含亮氨酸重复序列跨膜片段,这和以前克隆的抗病基因的特征相似。有关抗性基因在栽培品种中的检测技术和抗性基因在植物中高效表达的规律也有了深入的研究。不久,抗线虫甜菜将会应用于生产。2003年Cai等从甜薯的块根中分离出一种贮存蛋白基因(SpTI-1),它是一种Kunitz型胰蛋白抑制剂,具有抗昆虫取食的能力,并已在转基因烟草和花椰菜中得到验证。为了证实它是否对甜菜胞囊线虫具有抗性,他们采用农杆菌介导的转化体系,将其转入到栽培甜菜(BetavulgarisL.)中,通过Northern和Western杂交分析在所有的转化体中都有SpTI-1基因存在,12个转化的发根中有8个表现出对甜菜胞囊线虫有强烈的抑制作用。这种抑制不与表达的蛋白量有关、而和胰蛋白抑制剂的作用机理有关,但也不完全相同。相关的数据表明,胰蛋白抑制剂的活性是抑制甜菜胞囊线虫的关键因子,这一研究为甜菜胞囊线虫的治理提供了新的有效的抗取食的基因类型。2.2抗其他抗种基因番茄中的抗线虫基因—Mi是通过种间杂交胚胎挽救法(embryorescue)从野生种(Lycoperisiconperuvianum)导入栽培番茄种(L.esculentum)中的。Mi基因是单个显性或半显性的抗性基因。Aarts等通过染色体步查法对来源于野生番茄抗根结线虫(M.incognita)基因Mi进行了分子标记,发现与编码酸性磷酸酯酶(acidphosphatase)的Aps-1基因相连锁并定位在6号染色体。Tanaka等对Aps-1基因进行克隆,并鉴定了部分序列。由于Aps-1与Mi基因连锁,Cap等用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定酸性磷酸同功酶的活性筛选抗线虫基因Mi。1998年,对抗线虫基因的研究有了重大突破,Kaloshian等和Milligan等用定位克隆得到Mi基因,与其他已克隆的植物抗病基因具有相似性,即Mi编码的蛋白具有NBS(nucleotidebindingsite)和LRR(leucinerichrepeat)结构。Mi-1是广谱抗性基因,既抗根结线虫又抗马铃薯蚜虫(Macrosiphumeuphorbiae),同样位于6号染色体上的耐热抗线基因Mi-9也被定位和鉴定。番茄中的另一个抗线虫基因Hero定位在番茄的4号染色体上。它也是一个广谱抗性的基因,既抗马铃薯金线虫又抗马铃薯白胞囊线虫。2002年,Ernst等克隆了此基因,并对编码的蛋白结构进行了研究,发现也具有NBS和LRR结构,与其它抗性基因的产物相似。Nombela等研究发现Mi-1.2是多抗性基因。我们知道它抗根结线虫的同时还抗马铃薯蚜虫,现又显示出抗烟粉虱(Bemisiatabaci)的特性,是唯一的具有同时抗3种不同生物的基因。故而Mi基因在有害生物的综合治理中有重要的应用价值。2.3iii染色体上的工商型及遗传距离的确定抗马铃薯金线虫基因Gro1位点用限制长度多态性(RFLP)进行了分子标记。1996年Ballvora用RFLP、AFLP和RAPD对位于VII染色体上Gro1位点进行了精确定位,获得3个RFLP标记和1个RADP标记,在Gro1附近2个AFLP标记的遗传距离分别是0.6cM和0.8cM。抗马铃薯白囊线虫基因Gpa2通过定位的策略被克隆了出来。该基因和抗马铃薯X病毒的基因Rx1的蛋白序列有很高的同源性,均位于XII号染色体上。抗马铃薯线虫的基因H1用RFLP标记等位基因进行PCR分析诊断时,发现与Grol基因紧密相连,H1基因能导致马铃薯被取食部位的坏死。2.4小麦抗胞囊线虫基因的鉴定危害小麦的线虫有燕麦胞囊线虫、根腐线虫(Pratylenchusneglectus)和小麦粒瘿线虫(Anguinatritici)等。对小麦抗线虫基因研究较多的是澳大利亚和美国。1996年,Williams等通过标签Tag605探针鉴定出小麦抗胞囊线虫的基因位于品种AUS10894染色体2B上7cM处。抗小麦胞囊线虫基因Cre-3是通过作图法克隆的,它位于小麦染色体2D的长臂上,物理图谱距离为0.06cM。它编码的氨基酸有NBS和LRR结构,属于抗病基因的成员且在根中特异表达。在小麦中寻找抗性基因一直是抗病育种者的梦想,应用RGAs(Resistancegeneanalogs)法对抗线虫基因CreX在小麦中进行了定位。小麦中的另一个抗根腐线虫基因Rlnn1采用AFLP进行分子标记并定位在7A染色体上。另外几个抗性位点Cre1定位于2B染色体上。Cre2和Cre5是来自不同的抗源也分别标记在不同的染色体上。这对今后的小麦育种有重要的意义。2.5ssr标记的结构位点和基因连锁大豆胞囊线虫(H.glycines)是大豆生产上的一种主要病原物,运用大豆抗性基因的分子标记和克隆技术极大地促进了大豆抗病育种的进程。Mahalingam等以Excess×Peking的F2为材料,利用3个形态标记、108个RFLP标记和400个RAPD标记对大豆胞囊线虫3号小种抗性进行研究。结果表明,控制颜色(黑色)的i位点与3号小种的抗性基因Rhg4紧密连锁,相距仅0.6cM;另2个RFLP标记pA85a(连锁群A)、pA136(连锁群C)和3个RAPD标记E01(连锁群A)、G15d(连锁群F)和S07a(连锁群A)也不同程度的与抗病基因连锁。由此推断,3号小种的抗性受多个基因控制,属数性状遗传,而且每个基因位点的作用程度均不相同。Conciliido等以PI209332为抗源材料,也发现i位点与3号小种的抗性位点连锁。Concibido等通过对4个最广泛使用的抗源PI209332、PI90763、PI88788和Peking的分析,找到了4个与抗3号生理小种有关的数量特征位点(QRL),其中Rhg1的最为重要,因为在这几个抗性品种中都有此位点存在。此点是属于非小种抗性。这对抗线基因的克隆和大豆抗病育种有重要的意义。Meksem等将AFLP标记转化为STS标记,从10个AFLP中得到6个序列标签位点(STS)标记,与rhg1和Rhg4的位点相连锁的分子标记已被确定。Lewers用BAC文库和PCR方法对抗大豆胞囊线虫的主效基因Rhg4给予了精确的定位。Rhg4与影响大豆种皮的基因位点i和编码AK-HSDH(aspartokinasehomoserinedehydrogenase)的位点相邻。因为大豆对大豆胞囊线虫的抗性是受多个基因位点控制,遗传规律复杂,虽然有较多的研究,但没有突破性的进展,相信随着研究的深入,谜底最终会被解开。2.6抗线与rflp的分子标记在花生中,花生根结线虫引起严重病害,来自Arachiscardenasii的两个主效基因Mae和Mag可减少虫卵数量或限制结节的形成,这两个基因已被证实与RAPD、序列特征性扩增区域SCAR和RFLP位点紧密相连,这是花生中第1个有关抗线基因的分子标记。在大麦中,抗线虫(H.avenae)基因Ha1和Ha2(等位基因Ha3)已经被定位到2号染色体上。另一新的基因Ha4被定位到5号染色体上。在辣椒中,抗根结线虫的基因Me3和Me4也进行了精确定位,它们紧密连锁且具有热稳定性。3抗线虫基因的克隆依据已克隆的抗线虫基因所表达的蛋白质结构分析,发现它们有一些与其它R基因(Resistancegene)所据有的共同特征。如第1个被克隆出来的抗线虫基因Hs1pro1有LRR和NBS结构,Mi-1和Cre3其结构特征相似(表1)。通过大量的遗传学分析,LRR与蛋白质之间的相互识别有关。Hwang等对Mi编码蛋白的LRR进行了研究,表明这种结构与抗病信号传导有关,即与线虫的识别相关,证明其有调节局部细胞程序化死亡的作用。许多蛋白质中的NBS具有ATP或GTP结合活性,说明其在蛋白质磷酸化和去磷酸中改变蛋白质的构象,从而调节蛋白质的识别。已克隆的抗线虫基因都是用定位克隆(positionalcloning)的,如Mi-1、Cre3、Gpa2和Hs1pro1的克隆。既然它们都有共同的结构特征,我们便可利用它来克隆新的基因。Leister等根据烟草N基因和拟南芥中RPS2基因的保守序列设计PCR引物,对马铃薯DNA进行扩增,发现PCR产物是与已知抗性基因有同源性,而且与抗线虫基因位点Gro1和R7连锁。Bakker等根据马铃薯抗线虫基因Gpa2和抗马铃薯X病毒基因Rx1的LRR保守序列设计特异引物,获得9个抗性基因相似物(RGHs)均定位于在马铃薯XII染色体上,与Gpa2和Rx1相似率达93%~95%。Hunger等利用R基因的保守序列设计引物,从甜菜中分离出的47个抗性基因类似物(RGAs),其中有一类似物与Hs1pro-1相似。这种抗病基因类似序列(resistancegeneanalogs,简称RGAs)法,是克隆R基因的新思路,比定位克隆法简单直接。但得到R基因类似序列,并不等于得到了R基因,还要进一步检测这些序列与抗病性的共分离情况,从中得到R基因。4抗线虫基因的分子标记和克隆在植物线虫的综合治理中,种植抗性品种是防治植物线虫的一种简单而有效的措施。但是,目前许多作物中尚找不到合适的抗源材料,如葫芦科作物。正是由于抗线虫基因的克隆,为无抗源的作物抗线虫育种提供了机遇。然而,并不是所有的抗线虫基因