不同条件下活性载体提取甜瓜中的核酸

不同条件下活性载体提取甜瓜中的核酸

核酸是生物遗传的物质基础。这是合成蛋白质和结合细胞的重要生理活性物质。近年的研究还发现核酸有提高免疫力、记忆力、抗衰老等作用。我国有着丰富的海洋资源,鱿鱼是我国捕捞量较大的海产品。鱿鱼内脏中肝占有很大比重,而肝是含核酸最多的器官。科学合理地开发利用海洋资源对促进我国经济发展,提高人民健康水平,解决环境污染等重大问题都将具有重要意义。为此,本实验室构建了活性载体并摸索了其工艺的最佳条件,可以方便且较高效率的提取核酸。1材料和方法1.1材料表面鱿鱼肝脏由中国渔业水产总公司所提供,活性载体为本实验室构建,所用试剂均为国产分析纯试剂。1.2设备和检测仪器HZQ-F160全温振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),TDL-5000B冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),722分光光度计(上海第三分析仪器厂)。1.3方法1.3.1肝匀浆和活性载体混合溶液的制备称取新鲜鱿鱼肝组织100g,用匀浆器将之制成匀浆液,加入50mL蒸馏水,充分搅拌即为肝匀浆,约160mL,然后均分成16份,用于制备浓度为15%、10%、5%、3%的肝匀浆与活性载体的混合溶液各4份。将每种浓度的4份溶液分别培养24、36、48、72h,在4℃4000r/min进行离心,分别测定水相和沉淀中核酸的含量(核酸含量指RNA和DNA的总量)。1.3.2温度对测定酸提取的影响制备活性载体终浓度为10%的匀浆液6份,分别在20、25、30、37、40、42℃进行培养,36h后测定其中核酸的含量。1.3.3ph值对沉积物提取的影响制备pH值为4、5、6、7、8、9、10、11的肝匀浆与活性载体的混合溶液,培养36h后测定其中核酸的含量。1.3.4肝匀浆与活性载体混合对肝匀浆蛋白含量的影响在250mL无菌摇瓶中分别加入25、50、50mL的肝匀浆与活性载体的混合溶液,分别记为A、B及C组,其中C组充以氮气造成无氧环境,均在37℃培养,并测定其中的核酸含量。1.3.5模拟高温照射条件制备30份新鲜肝组织与蒸馏水2∶1混合而成的匀浆,分别装入30个经过消毒的摇瓶;分成A、B、C三组,10个为一组。准备2个暗箱,一个提供黑暗条件,一个内置40W的日光灯管以模拟日光照射条件。将3组摇瓶按照以下要求分别置于不同的暗箱中:A组24h置于黑暗中,B组给予12h持续日光灯照射另12h处于黑暗中,C组24h给予日光照射,分别测其核酸含量。2结果2.1活性载体浓度对核酸含量的影响水相中的核酸在载体浓度为10%、培养36h的时候含量最高,但沉淀中的核酸却是在培养72h、浓度3%时含量最高。由于沉淀中核酸的最远低于水相中核酸的含量,故总的来说,在培养36h、活性载体浓度10%的时候可以使核酸的产量达到最大。沉淀和水相均可以进一步纯化。经我们摸索和对比,用乙醇、醋酸钠处理效果比较好。2.2温度对测定酸提取的影响在20~37℃,温度升高,载体活性增强,所能提取的核酸量也增高;但37℃以后随着温度的升高,载体活性下降,核酸的提取量也下降。2.3不同ph值对沉积物提取的影响在pH为3以下和pH为9以上的培养基中,活性极低;而在pH=6.0左右时载体活性比较强,核酸的产量最高。2.4核酸量在不同装样量的条件下,每10mL培养液所能提取的核酸量:A组53.8mg,B组98.1mg,C组132.7mg。可以看出当培养液充以氮气时即无氧状态时核酸含量最高,可能活性载体为一厌氧型载体。2.5不同照明条件下提取酸酸的影响经过观察三组摇瓶中活性载体的生长情况并测核酸含量结果见表1。经统计分析提示:24h在黑暗中培养后提取核酸量最高,且具有显著性。3活性载体法提取核酸的最佳条件目前,提取核酸有多种方法,一般均为化学方法。本研究是在核酸的提取过程中运用本实验室构建出的一种新型载体——活性载体,使核酸的提取过程简化,提取量增加。我们首先根据经验,使其在37℃、培养基pH近中性的条件下,培养一定时间,从而得出最佳培养时间及载体浓度;然后进一步探讨光照、培养液氧溶量、pH值、培养温度等因素对核酸提取量的影响,发现把10%活性载体与肝匀浆的混合液在黑暗条件下、无氧、37℃、pH值=6.0的培养基中培养36h后,测得水相及沉淀中的总核酸含量最高,而且水相中的核酸含量较沉淀中为高。分析原因可能为:所提取的核酸是以RNA为主。RNA主要存在于细胞质中,DNA主要存在于细胞核中,经活性载体处理后细胞质中的RNA被释放入培养基中而大部分DNA仍位于细胞核中,再经离心处理则水相中RNA含量高,沉淀中DNA含量高;又由于RNA在细胞中的含量比DNA高,所以水相中的核酸含量较沉淀中为高。因此我们得出活性载体