温湿度对南方根结线虫2龄幼虫致病作用的研究

温湿度对南方根结线虫2龄幼虫致病作用的研究

根节点是植物的重要致病性控制。常见的植物，如南方根节点、水生植物根节点和其他植物，可能会导致严重的有害行为。产量通常超过10%-30%，严重病例达到50%以上。根结线虫主要危害植物根部,在根部形成串球瘤状根结,破坏根组织的分化和生理活动,影响地上部分生长发育。化学药剂至今仍是防治根结线虫病害的重要手段,常用药剂如涕灭威、克线磷或溴甲烷熏蒸剂,但这些药剂高毒高残留且严重危害环境和生物多样性,在蔬菜生产中已严格限制使用或禁用。因此,寻求高效、环境友好和无残留的根结线虫病综合治理技术已成为当务之急。我国设施园艺蔬菜根结线虫病害日益严重,已经从南至北蔓延到辽宁的大部分地区。能否利用生态控制技术经济有效地防治根结线虫病害?美国等发达国家早已研究过根结线虫的生物学特性,对发育时间和温湿度等有多篇报道,而近年来又侧重于基因工程抗病育种和生物防治等各方面的研究,尤其在温湿度方面研究集中于与生防因子协同作用。我国有关根结线虫病害的研究从20世纪80年代开始,除常规的化学药剂、生防因子的筛选外,人们较少注意到生态控制中温湿度等重要因素的影响,但温度、湿度是影响线虫生长发育最为重要的因素,每一种根结线虫都有其适宜的生长发育温湿度,因此,研究我国不同地区不同种类根结线虫对温湿度的反应具有重要意义。辽宁省于1996年首次发现根结线虫至今,线虫病害已成为设施园艺蔬菜生产中的主要病害之一。但此前北方地区没有根结线虫的危害报道,因此,本文着重在温湿度方面入手,以辽宁省温室大棚内优势根结线虫种群南方根结线虫为靶标,测试不同温度和湿度对其卵囊中卵孵化和2龄幼虫(J2)活性的抑制作用,以期获得理想的温湿度组合,为北方保护地蔬菜生产中利用生态条件控制蔬菜根结线虫病害提供技术支持,也为我国不同地区设施园艺进一步实施生态控制根结线虫病害提供基础数据和理论指导。1材料和方法1.1卵囊的消毒处理供试线虫采自沈阳市东陵区浑河站乡前塞村番茄温室大棚内,本实验室利用感病寄主番茄L402(由辽宁省农业科学院提供)进行单卵囊无菌扩繁(卵囊用0.5%的NaClO消毒1min后用无菌水冲洗3次,将单个卵囊接种在无菌土培养的番茄幼苗上)。接种1个月后,番茄根系上有大量卵囊出现,取出根系,用水轻轻冲洗,小心从番茄的根结表面挑取新鲜卵囊,分离雌虫,制作雌虫会阴花纹,测量J2体长、体宽、口针长度,并且对根结线虫雌虫进行酯酶同工酶电泳鉴定,鉴定结果为南方根结线虫(M.incognita)。1.2贝氏小饼保湿温度设置为-15、0、5、10、15、20、25、30、35、40、42℃。每个温度处理3次重复。设置2组试验:一组在贝氏小皿中放入J2,加入无菌水200μL;另一组放入卵囊,加入无菌水200μL,观察活性。同一个处理的3个小皿放在1个大皿中加盖,底部用湿滤纸保湿。对J2进行连续15d的观察,记录死亡J2数量,从第1天起每2天记录1次,对卵囊卵孵化进行连续5d的观察,记录孵化J2数量,每天记录1次孵化结果。1.3不同含水量土壤水分测定将沙子用60目网筛过滤,获得细沙。烘箱调至80℃烘干12h后,冷却至室温,用精确度为0.01g的电子天平称取30g干沙置于直径为6cm,高为1.5cm的培养皿中,加无菌水分别配置成含水量为1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%的沙土。土壤含水量(质量浓度)=(原土质量-烘干土质量)/烘干土质量×100%=水质量/烘干土质量×100%。设置2组试验:一组将J2(100条左右)放入不同含水量沙土的皿内,第二组将1个卵囊放入不同含水量沙土的皿内,在皿盖内加湿滤纸保湿,并用封口膜密封好,每天称重补水后再密封好。在室温下(22℃)卵囊在不同含水量的皿内孵化5d,J2在皿内培养6d。调查时将皿内的沙土转移到贝曼漏斗中,利用漏斗法分离活的J2,分离2d后统计J2数量。1.4不同温度对卵囊孵化的影响设置几个对J2致死率较高、卵囊中卵孵化率较低的处理组合,J2处理条件为:沙土含水量5%、10%、20%和30%,温度为:-15、0、35℃和40℃。卵囊孵化条件为:沙土含水量10%、20%、30%,温度为5、15、35℃和40℃,可以获得28个不同的处理组合。每个处理3次重复,处理时间为3d。贝曼漏斗法分离2d后计数J2数量(分离J2和调查的具体方法同1.3)。1.5卵囊的消毒分离所用的J2为卵块孵化7d所得,卵囊为培养60d后从番茄根部挑取新鲜卵块,在解剖镜下观察筛选大小相近,卵粒饱满数量相近的卵囊。单因素温度试验每个重复加入J250条左右,卵囊约加入1个。单因素湿度试验每个重复加入J2100条左右,卵囊1个。卵囊用擦镜纸包好后埋入装有不同含水量的沙土皿内,在贝曼漏斗法分离之前取出纸包。目的是将孵化的J2和未孵化的卵粒分离开,以备下一步的贝曼漏斗法分离检查。温湿度两因素试验J2用量为每个重复100条左右,卵囊为1个,卵囊的用法和孵化情况检查同上。1.6死亡就业测定用毛针刺激J2鉴定J2死活,刺激时间为10s,不活动视为死亡,否则视为存活。用贝曼漏斗分离J2时,分离时间为2d,未分离出的J2视为死亡,分离出的J2视为存活。2结果与分析2.1南方根结线虫高温不同温度对南方根结线虫J2的影响十分明显,其中-15℃下经1d处理对J2致死率即达到100%。其次40℃和42℃分别在5d和3d后致死率达100%。35℃处理11d后线虫死亡率可达80%,而0～5℃和30℃处理15d以上线虫死亡率才能够达到62%以上。从上述结果可知南方根结线虫J2的不适宜低温范围是0℃以下、不适宜高温范围是40℃以上。在15d的观察期内J2在10～25℃均适宜存活,死亡率不超过14%,而15～20℃为最适温度范围,在这一温度范围内南方根结线虫J2均可正常存活,死亡率在5%以内(表1)。2.2南方根结线虫的孵化经过5d的南方根结线虫卵孵化试验发现,-15℃和42℃卵囊中卵未孵化,而且恢复室温(25℃,10d)后仍然无法孵化,说明此2个温度对南方根结线虫卵囊中卵孵化有强烈的抑制作用,而且恢复适宜条件也不能够孵化,可能对部分卵的生理活性有破坏作用。在0℃和35℃条件下,仅在第1～2天内有少量孵化,第3天后即停止孵化,但5d后恢复室温卵囊还可以正常孵化,说明这2个温度对南方根结线虫的卵孵化具有明显的抑制作用,但根结线虫对此温度有一定的抗性,恢复适宜条件线虫仍可孵化,说明卵未被破坏。试验结果显示5℃和10℃亦不适宜卵囊中卵孵化,孵化率很低。15℃～30℃是南方根结线虫的适宜孵化温度,5d内均可以正常孵化,但20℃孵化出的J2数量最多,孵化高峰在第3天;25℃时2d达到孵化高峰;30℃条件下线虫孵化最快,1d即达到孵化高峰,但以后的孵化率逐渐降低至不孵化(表2)。2.3土土含水量对j2水生动物生长的影响在室温(22℃)不同湿度下卵囊经过3d的孵化、J2经过6d的培养结果如图1所示。J2在1%～30%含水量的沙土里存活量有较大差异,在含水量为25%时分离出活的J2数量最多,当沙土含水量低于1%时J2的死亡率增加,高湿条件(含水量高于30%)时对J2也有一定的抑制作用。卵囊在不同含水量的沙土中孵化量亦有一定差异,干旱条件不适宜卵囊中卵的孵化(含水量低于1%),而当沙土含水量5%时卵囊中卵的孵化最多(图1)。数据差异显著性由SPSS软件分析获得。2.4根结线虫病害的防治利用对南方根结线虫致死率较高的温度与不同湿度组合处理(表3),结果显示:40℃下不同含水量沙土对J2和卵囊中卵孵化均可抑制,说明40℃的高温处理可能被应用于设施园艺中控制根结线虫病害的发生,当然具体的操作还需要进一步结合寄主植物加以研究。低温条件下-15℃和0℃的不同含水量组合分离到J2数量都很少,只有含水量10%与0℃的组合J2数量略多,但仅为10余条线虫;而5℃下卵囊中卵也几乎不能孵化出J2,说明0～5℃低温能够有效抑制南方根结线虫的卵孵化和J2存活。在35℃下30%含水量组合卵囊中卵孵化受到抑制,而且对J2的致死作用也比较显著,说明高温高湿也会有一定效果,但低温对南方根结线虫的控制更显著,在生产实践中应用还需要具体情况具体分析。3不同温度对南方根结线虫抗旱性的影响设施园艺的兴起使蔬菜根结线虫病害的发生日益严重,但温室大棚的可控条件使得温湿度研究更具有意义。因此研究线虫对温湿度的敏感性并获得其抑制性温度和湿度,将可能用于生态控制技术,控制南方根结线虫的活性与繁殖。国外研究线虫的生物学特性较早,但有关应用温湿度控制根结线虫的研究较少,印度有人做过这方面研究,但由于印度的高温干旱气候,低温处理研究方面成为缺憾。我国地域广阔,气候差异很大,由于北方地区夏热冬冷,利用温湿度控制南方根结线虫是可行的有效措施之一。本试验的研究结果显示,南方根结线虫对温度极为敏感,40℃以上高温和5℃以下低温是南方根结线虫的有效抑制温度。除干旱和高湿外,湿度对南方根结线虫影响较小,但结合温度试验,则显示任何湿度条件下的低温和35℃高温高湿(30%含水量)条件对南方根结线虫都有抑制作用。有研究报道马铃薯繁殖南方根结线虫的最适温度为24～28℃,12℃时线虫发育十分缓慢,接种后49d调查还未能观察到线虫产卵。说明线虫对10℃左右的较低温度仍很敏感。有报道利用地膜覆盖技术控制黄瓜根结线虫,主要利用膜下灌水的方式增加湿度、创造高温高湿的环境,取得较好的防治效果。也有研究发现土壤含水量在3.90%～8.98%条件是番茄根结线虫病发生的最适湿度。陈志杰等通过盆栽试验发现45℃处理8h,黄瓜根结线虫病发病程度减轻98.8%,50℃处理8h可达100%。各研究结果表明利用温湿度控制根结线虫病害已成为可能,只是对线虫的最佳抑制温湿度数值存有争议。本研究实验室培养皿中的研究数据表明低温(<5℃)、干旱(含水量<1%)和高温高湿(>35℃、含水量>30%)条件可以有效抑制南方根结线虫的J2存活和卵囊中卵孵化。卵囊中卵孵化对低湿条件有一定的抗性,但RH=0条件下J2会立即死亡,本研究的预备试验也显示含水量为0时J2死亡、卵囊中卵不孵化,因此设置含水