饲粮添加刺五加多糖对大肠杆菌脂多糖免疫应激断奶仔猪免疫器官指数、粪便微生物菌群数量及胃肠道ph的影响

饲粮添加刺五加多糖对大肠杆菌脂多糖免疫应激断奶仔猪免疫器官指数、粪便微生物菌群数量及胃肠道ph的影响

早期断奶是现代猪生产中为了提高猪的生产性能和栏舍利用率而实施的一项常见措施。但是由于仔猪消化系统和免疫系统等尚未发育完善,受到饲粮、环境、心理等改变的影响,仔猪极易发生免疫应激,从而导致厌食或拒食、消化功能紊乱、断奶后腹泻等现象,最终引起仔猪生长抑制,给养猪生产造成了严重的经济损失。刺五加是我国传统中草药,其水提物具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide,ASPS)作为刺五加水提物的活性成分之一,本课题组前期研究已经表明饲粮添加ASPS能改善断奶仔猪的生长性能,降低腹泻率,增强免疫功能,还能缓解仔猪的免疫应激反应。本试验应用课题组前期研究探明的800mg/kgASPS的最适剂量,用脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激断奶仔猪以建立免疫应激模型,研究ASPS对免疫应激仔猪免疫器官指数、粪便微生物菌群数量及胃肠道pH的影响,探讨ASPS的免疫保护和肠道调节作用,旨在为ASPS的营养调控作用提供理论依据。1材料和方法1.1降血清型-lsASPS:委托陕西慈缘生物技术公司按照试验要求利用水提醇沉工艺从刺五加根中提取,苯酚-硫酸法测得ASPS纯度为92.7%。LPS:大肠杆菌血清型为O55:B5(Sigma公司),临用时配制。精确称取LPS,用灭菌生理盐水配成浓度为500μg/mL,超滤除菌。基础饲粮参照NRC(1998)仔猪营养需要配制的粉状饲料,其组成及营养水平见表1。1.2试验分组与饲养试验采用2×2因素设计,即饲粮处理(添加或不添加ASPS)和免疫应激处理(注射LPS或等量生理盐水),试验期21d。将64头28日龄断奶、平均体重为(7.22±0.46)kg的“杜×长×大”杂交断奶仔猪随机分为4组,每组4个重复,每个重复4头猪。1、2组饲喂基础饲粮,3、4组饲喂在基础饲粮中添加800mg/kgASPS的饲粮,试验第14天,2、4组仔猪腹腔注射100μg/kgBWLPS,1、3组仔猪注射等量生理盐水。仔猪采用半开放猪舍,地面饲养,自然通风,自由采食和饮水,免疫和驱虫程序按猪场常规同步进行。1.3新鲜粪样的测定试验第21天,每个重复随机采集1头仔猪直肠未污染的新鲜粪样;然后,每个重复随机取1头仔猪,采用颈静脉放血的方法处死,立即屠宰,采集仔猪的免疫器官和各段胃肠道样品,进行免疫器官指数和胃肠道pH的测定。1.3.1稀释液的配置采用平板计数法检测粪便微生物中乳酸杆菌和大肠杆菌数量。在无菌操作台内称取1.0g粪样与9mL灭菌生理盐水配制成10-1稀释液,用微量移液器移取1mL该稀释液至装有9mL灭菌稀释液试管中,振荡2min,配制成10-2稀释液,再依次进行10-3~10-7稀释。将稀释液接种于MRS培养基和麦康凯培养基中,大肠杆菌在37℃有氧培养20h后计数,乳酸杆菌在37℃有氧培养36h后计数,每个菌种选择3个梯度,每个稀释梯度重复3次,粪便微生物数量用lg(CFU/g)(每克肠道内容物中含菌落总数的对数)表示。1.3.2免疫组化计算免疫器官指数分别采集仔猪的脾脏、胸腺、下颌淋巴结、肝脏,称量湿重,计算免疫器官指数。免疫器官指数(g/kg)=器官湿重(g)/胴体重(kg)。1.3.3肠道内容物ph的测定仔猪屠宰后,用解剖剪立即剪取胃、十二指肠(末端)、空肠(中段)、回肠(中段)和盲肠(中段)各5cm,采用pHB-2型便携式pH计直接测定各段胃肠道内容物的pH。1.4双因素方差分析数据经Excel2007初步整理后,采用SPSS16.0统计软件的GLM程序进行双因素方差分析。数据以“平均值±标准误”表示。采用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05时确定为差异显著。2结果2.1饲粮和饲粮在不同基础饲粮的脏器和外周血淋巴结指数的变化由表2可知,与没有LPS免疫应激仔猪比较,LPS免疫应激使仔猪脾脏指数和胸腺指数分别显著降低了8.85%(P<0.01)和13.18%(P=0.023),对肝脏和下颌淋巴结指数无显著影响(P>0.05)。饲喂ASPS的仔猪脾脏指数和胸腺指数与饲喂基础饲粮的仔猪比较分别显著提高了20.06%(P=0.012)和35.38%(P=0.019),但对肝脏指数和下颌淋巴结指数影响均不显著(P>0.05)。饲粮添加ASPS与LPS免疫应激的互作效应对胸腺指数(P=0.047)和脾脏(P=0.031)指数影响显著,即添加ASPS能缓解LPS免疫应激引起的脾脏指数和胸腺指数的下降。对于LPS免疫应激的仔猪,饲喂ASPS较饲喂基础饲粮的仔猪显著提高了胸腺和脾脏指数(P<0.05)。2.2饲粮盐析、养食安全与lps免疫应激互作效应由表3可知,与没有LPS免疫应激的仔猪相比,LPS免疫应激显著降低了仔猪粪便乳酸杆菌数量(P=0.023)。饲粮添加ASPS仔猪粪便乳酸杆菌数量较饲喂基础饲粮的显著提高了5.07%(P=0.043),大肠杆菌数量显著降低6.04%(P=0.036),饲粮ASPS与LPS免疫应激互作效应对粪便乳酸杆菌数量影响有显著的趋势(P=0.050),即添加ASPS能缓解LPS免疫应激引起的粪便乳酸杆菌数量下降。此外,对于LPS免疫应激的仔猪,饲喂添加ASPS较饲喂基础饲粮仔猪粪便大肠杆菌数量显著下降(P<0.05),乳酸杆菌数量显著升高(P<0.05)。2.3饲粮缺乏对盲肠内容物ph的影响由表4可知,与没有LPS免疫应激的仔猪相比,LPS免疫应激对仔猪胃、十二指肠、空肠内容物pH影响均不显著(P>0.05),但使回肠和盲肠内容物pH分别显著提高了2.96%(P=0.048)和1.58%(P=0.045)。与饲喂基础饲粮仔猪相比,饲喂ASPS的仔猪回肠和盲肠内容物pH分别显著下降了3.62%(P=0.041)和2.74%(P=0.037),但不影响胃、十二指肠和空肠内容物pH(P>0.05)。饲粮ASPS与LPS免疫应激互作效应对盲肠内容物pH影响显著(P<0.05),即添加ASPS能缓解LPS应激引起的盲肠内容物pH的升高。此外,对于LPS免疫应激的仔猪,饲喂ASPS较饲喂基础饲粮仔猪回肠和盲肠内容物pH显著下降(P>0.05),提示饲粮添加ASPS能降低处于免疫应激状态仔猪肠道内容物pH。3讨论3.1对免疫调节的作用LPS是革兰氏阴性细菌壁的大分子成分,在动物营养免疫学研究中,注射LPS是建立动物免疫应激模型的主要方式。本课题组前期研究表明,LPS免疫应激的仔猪出现了生长抑制、饲料效率降低,证明了通过注射LPS的仔猪免疫应激模型构建是可行的。仔猪的中枢免疫器官包括骨髓和胸腺,外周免疫器官主要包括脾脏、淋巴结,是成熟的胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞)、骨髓依赖性淋巴细胞(B细胞)定居、增殖和对抗原刺激产生免疫应答的场所。脾脏内约含40%的T细胞和60%的B细胞,在体液免疫中起重要的作用;淋巴结是接受抗原刺激产生免疫应答反应的场所,起过滤、增殖和消除异物的作用。动物的免疫器官重量和其指数是评价机体免疫状态的常用指标,免疫器官重量的增加是生长发育快的表现,而免疫器官指数的提高则意味着免疫系统成熟较快。大量研究表明,多糖能促进正常机体或免疫功能低下的机体免疫器官的发育,增加免疫器官重量,提高机体的免疫力。Chen等研究发现,肉仔鸡饲粮添加200mg/kg牛膝多糖能提高其法氏囊指数。芦殿荣等报道了小鼠皮下注射香菇多糖能增加正常小鼠和免疫抑制小鼠胸腺重量和脾脏重量。袁学千等的试验证实了ASPS能增强小鼠脾脏和肠系膜淋巴结的细胞数目、脾脏白髓总体积和淋巴结皮质总体积。提示ASPS对动物免疫器官的发育具有促进作用。但截至目前,还没有关于ASPS对动物免疫器官重量和指数直接影响的报道。本试验研究表明,饲粮添加800mg/kgASPS能显著提高免疫应激仔猪脾脏和胸腺指数,提示ASPS能通过促进免疫器官发育而改善免疫应激仔猪机体的免疫功能。3.2饲粮添加盐对免疫应激小道细菌细菌数量的影响有研究报道,多糖能够作为有益菌的生长底物,促进乳酸杆菌生长从而可竞争性抑制大肠杆菌的增殖,进而改善仔猪肠道微生物菌群的结构,促进肠道微生态平衡。以往有很多关于刺五加水提物调节断奶仔猪肠道微生态平衡的报道。燕富永等和尹富贵等试验均表明,刺五加水提物能增加断奶仔猪肠道乳酸杆菌、双歧杆菌等有益微生物数量,减少大肠杆菌等有害微生物数量。王淑洁等研究表明刺五加水提物能够促进犊牛消化道内乳酸杆菌的繁殖,从而使犊牛肠道有益菌的数量有增加的趋势。本试验结果表明,饲粮添加800mg/kgASPS能显著增加免疫应激仔猪粪便乳酸杆菌数量,减少大肠杆菌数量,试验结果与杨侃侃等报道的ASPS能显著提高断奶仔猪粪便中乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌数量的结果相一致,提示饲粮添加ASPS对免疫应激仔猪肠道微生物菌群具有调节作用。动物的胃肠道不但是机体营养物质消化吸收的重要场所,而且还能通过多种非特异的免疫机制和免疫防御机制,形成阻止外界环境中有害物质入侵机体的天然屏障。其中,胃肠道酸度是影响机体消化吸收的重要因素,维持断奶仔猪消化系统正常生理功能所需的适宜酸度是确保仔猪机体健康的重要措施。健康仔猪胃肠道中的致病菌如大肠杆菌适宜在中性偏碱性的环境中生存,而乳酸杆菌则适宜在酸性环境中增殖。免疫应激的仔猪胃肠道pH升高,容易使大肠杆菌快