苦木提取物对人肝癌细胞hepg-2的生长抑制作用

苦木提取物对人肝癌细胞hepg-2的生长抑制作用

肝癌是中国常见的肿瘤之一。这是中国第二肿瘤的“杀手”，也很常见于中年男性。因其治疗难度大,患者生存时间短,故人称“癌中之王”。众所周知,天然产物也是抗癌药物的重要来源,我国已有数千年使用中草药治疗肿瘤疾病的历史,早在《黄帝内经》中已有肿瘤的记载。目前已报道有抗肿瘤活性的植物超过400种,从20世纪40年代起到2006年6月,全球应用的175种抗癌药物中,有57%直接或间接来源于天然产物。而且我国地域辽阔,各地气候差异悬殊,植物资源丰富,种类繁多,从中筛选出新型高活性抗肿瘤化合物具有极大优势。苦木[Picrasmaquassiodes(D.Don)Ben]为苦木科苦木属植物,为我国南方民间常用药。该药的性味苦寒,有小毒,具有清热燥湿、解毒等功效。临床上多用于抗感染、降血压等方面。该科植物所含化学成分主要为苦木苦味素(Quassinoids)和生物碱,其次为三萜、甾醇、皂苷、香豆素、醌类等。苦味素多为四环三萜内酯及五环三萜内酯,是该科的特征性成分,有解热、驱虫、治阿米巴痢疾及杀虫作用。近期研究表明,苦木科植物中所含的苦木苦味素类成分具有显著的抗癌活性,备受人们关注,但其抗癌作用机理的研究目前确却少有报道。本研究选用富含此类成分的中药苦木进行考察,采用乙醇回流提取,观察提取物对人肝癌HepG-2细胞株增殖的影响,以期从中挖掘干预肝癌生长的中药活性成分,为中药研究提供相应的物质和理论基础,以探讨中药苦木对人肝癌细胞的作用机制。1材料和机器1.1细胞植物人肝癌细胞HepG-2,购自中国医学科学院基础研究所细胞中心。1.2血清mtt苦木,购自北京利君堂药店,货号070611;高糖DMEM培养基,胎牛血清(美国Gibco公司产品);四甲基二氮唑蓝(MTT,北京索来宝科技有限公司);二甲基亚砜(北京北化精细化学品有限责任公司,分析纯),TUNEL试剂盒(编号XS-1221)购自于北京中昊时代生物技术中心。1.3碳培养箱、超净工作台和细胞培养瓶BIO-RAD550型酶标仪(美国BIO-RAD伯乐公司产品);3111型二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司产品);超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司产品);细胞培养瓶,96孔细胞培养板(美国Corning/Costar产品);倒置显微镜(重庆光学仪器厂);十万分之一天平(德国赛多利斯产品)。2细胞凋亡dmem的检测2.1细胞培养将HepG-2细胞接种于细胞培养瓶中,培养基为DMEM(含100mL/L胎牛血清,青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL),置于37℃、5%CO2培养箱,相对饱和湿度的条件下培养。在细胞长满后,在培养瓶内加0.25%胰酶,37℃消化3～5min,1∶3传代,置37℃、5%CO2培养箱,相对饱和湿度的条件下继续培养;隔日换液,3～5d长满。2.2苦木提取物的制备取苦木200g,将其与95%乙醇按质量以1∶3)混合后80℃回流提取3h,抽滤,收集提取液。回流提取3次,将所得的提取液合并后进行真空减压浓缩、真空干燥至恒重,得到提取物。2.3MTT法检测细胞增殖取对数生长期的肝癌细胞HepG-2用0.25%的胰蛋白酶消化,配成5.0×104/mL细胞悬液,再将其接种至96孔培养板中,每孔200μL,于37℃、5%CO2的培养箱内培养24h;待细胞完全贴壁后,实验组每孔加入含不同浓度(6.25、12.5、12.5、25、50、100μg/mL)苦木提取物的DMEM培养液200μL,对照组加入含等体积药物溶剂的DMEM培养液200μL;另单设不含细胞的200μLDMEM培养液为空白对照组;各浓度及时间均设3个平行孔,培养24、48、72h后各孔分别加入20μL5g/L的四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液,再培养4h后,倾去各孔培养液,各孔加入200μLDMSO,15min后用酶标仪在490nm下测定各孔光密度D(λ)值,计算药物各浓度对HepG-2细胞的抑制率,并计算增殖抑制率,并以LOGIT法来计算IC50。抑制率(%)=1-D(λ)实验组-D(λ)空白组D(λ)对照组-D(λ)空白组×100%(%)=1−D(λ)实验组−D(λ)空白组D(λ)对照组−D(λ)空白组×100%2.4TUNEL法检测凋亡细胞将浓度为5×104/mL的HepG-2细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清净的盖玻片上,用DMEM培养基于37℃、5%CO2条件下在6孔板中培养24h后,每孔加入不同浓度的苦木提取物(72h的IC50,50μg/mL),72h后取出盖玻片,PBS冲洗3次。0.1%Triton-100破膜,4%多聚甲醛固定,H2O2阻断。用TDT法将生物素标记的d-UTP在末端转移酶的作用下,标记到DNA的5′端缺口上,再用亲和素标记的HRP与之结合,然后加人底物DAB显色,甲基绿复染,从而使细胞核呈现棕褐色,未凋亡细胞核呈蓝绿色。随机观察5个视野,每个视野计数200个细胞,按下式计算细胞凋亡率:细胞凋亡率/%=凋亡细胞细胞总数×100%/%=凋亡细胞细胞总数×100%2.5统计学处理数据均以ˉx±sx¯±s表示,用生物统计学软件SPSS13.0对各个组进行单因素方差分析来比较组间差异;以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1中药苦木醇提物对人肺癌细胞hepg-2的抑制作用苦木提取物在不同时间及不同浓度下对HepG-2细胞的生长抑制结果如表1所示,不同浓度(6.25～100μg/mL)的中药苦木提取物在连续处理HepG-2细胞72h后,各剂量药物组的D(λ)值都随着药物浓度的升高而显著降低。表明苦木提取物对人肝癌细胞HepG-2生长具有抑制作用,且呈现剂量-效应关系。苦木提取物对人肝癌细胞HepG-2的生长抑制作用随着药物浓度的升高而增强的同时,其抑制效果也与作用时间呈正相关。当苦木提取物的作用浓度为6.25μg/mL作用24h时无任何的抑制作用,而当作用时间延长到48、72h时,对细胞的抑制率分别增长到了9.8%和9.9%;当苦木提取物的作用浓度为100μg/mL,在作用时间分别为24、48、72h时,可使85%以上的细胞生长受到抑制。苦木提取物作用HepG-2细胞72h的IC50为19.51μg/mL,其作为植物粗提物的IC50<20μg/mL,并且有细胞毒性的剂量依赖性关系,其最高抑制率达到了90%以上,则判定苦木的醇提物在体外对人肝癌细胞HepG-2有抑制作用。各个剂量的中药苦木提取物作用人肝癌细胞HepG-2以后,细胞的增殖速度显著减缓,对细胞生长的抑制作用随着药物浓度的升高和药物作用时间的延长而显著增强且呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。该实验结果表明,苦木提取物对肿瘤细胞生长的抑制呈现浓度和时间的依赖性。3.2苦木提取物对hepg-2细胞凋亡的影响当用19.51μg/mL(IC50)的苦木提取物处理HepG-2细胞72h时,可见有一定数量的凋亡体积显著缩小,细胞变圆,核染色质浓缩,凋亡率为40.6%;当提高浓度到50μg/mL处理HepG-2细胞72h时可见凋亡细胞的数量显著增多,凋亡率为59.8%;而对照组,未见明显的凋亡现象。见图1。由图可见,对照组HepG-2细胞72h后,未见显著凋亡,细胞分布均匀,大小正常,胞核绿染。苦木提取物IC50实验组苦木提取物作用于HepG-2细胞72h后,部分凋亡细胞核呈现棕褐色。苦木提取物50μg/mL实验组苦木提取物作用于HepG-2细胞72h后,细胞数量减少,出现大部分凋亡细胞,胞核呈现棕褐色。表明苦木提取物具有诱导HepG-2细胞凋亡的作用。4苦木提取物体外作用对人肺癌细胞hepg-2增殖的影响肿瘤是危及人类生命的首要顽疾,药物治疗为中西医肿瘤治疗中的一个重要模式。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定,其机制有多方面,如抑制DNA合成、抑制肿瘤血管形成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、调节机体免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)活性等。目前,抗肿瘤药物按其来源大致可以分为:化学合成药物、植物来源药物、微生物来源药物(抗肿瘤抗生素)和生物技术药物,其中来源于天然植物的药物在抗癌药物领域发挥着重要作用。目前对苦木的研究表明其富含苦木味素类活性成分。Shinsaku等已发现苦木中的3种成分对P388白血病细胞有抑制活性。但是苦木对肝癌的生长干预未见相关文献报道。本研究采用MTT法检测了不同浓度的苦木提取物不同时段体外对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响,实验结果表明:苦木提取物对细胞的最大无毒浓度为6.25μg/mL;与对照组比较,50、100μg/mL剂量组对HepG-2细胞的增殖有显著的抑制作用(P<0.05),并且随着作用时间的延长,抑制效果更加显著,呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。同时采用TUNEL法证明,苦木的提取物作用细胞72h后,显示出显著的凋亡特征;且随着苦木提取物作用浓度的增加,凋亡细胞的数目也会随之增多。可见,苦木提取物对人肝癌细胞HepG-2细胞有显著的抑制作用,其抑制作用与剂量及作用时间呈正相关,细胞凋亡是杀灭肿瘤细胞的主要途径,本研究显示苦木提取物能诱导HepG-2细胞发生凋亡,但高剂量的药物作