乳酸菌食品级基因表达系统的研究进展

乳酸菌食品级基因表达系统的研究进展

蘑菇是一个可以用养分产生硫酸的革兰氏阳性菌的总称（杨杰斌等人，1996），而乳突阳性细菌是公认的食品安全微生物，已成为食品工业和制药等领域的研究热点（张震等，2009）。乳酸菌作为基因工程菌表达外源蛋白不会产生内毒素,表达的产物直接与人类健康有关系。此外,选择乳酸菌作为表达宿主菌是因为其具有益生功能,可以通过改善人和动物菌群平衡,对机体产生益生作用,抵御外来致病菌的入侵,对常见致病菌有颉顽作用,并具有调节微生态平衡、营养、免疫赋活、抗氧化、抗突变和抗辐射作用,以及改善便秘、降低胆固醇、减缓乳糖不耐症等功效(刘小青等,2009)。乳酸菌自身及其各种代谢产物对机体有营养和免疫功能,而且乳酸菌可以在肠道中定植存活,口服基因工程乳酸菌后,乳酸菌表达的用于治疗或免疫作用的蛋白就可以源源不断地在肠道中产生并起到相应的作用。1表达能力的测量以乳酸乳球菌为例,几乎所有的乳酸菌都是植物活性化合物产物的主要宿主菌,这主要是由于它们的食品级地位、高效率的表达能力及其能够作为代谢工程的工具(Igor等,2007)。近些年,有关乳酸菌的一些调控元件、代谢机制已被研究清楚,并建立了一系列适合乳酸菌的表达系统(Mathiesen等,2004),包括糖诱导的表达系统、噬菌体φ31暴发式诱导的表达系统、乳链球菌素调控表达系统、温控表达系统等。1.1e.coli和l.lactis近几年,LAB的遗传工具得到了很大的发展(Loir等,2005),包括内源性质粒的去除、电穿孔方法的建立、各类表达信号的分离和克隆等,已建立了一系列具有不同用途的克隆载体、表达载体、选择标记和突变系统。L.lactis有许多优点可以用于大规模基因表达,并代替E.coli成为异源蛋白表达的宿主菌(Mierau等,2005)。Douwe等将草莓中的两种基因克隆在乳酸杆菌中,并利用尼森诱导表达系统高效表达,结果提高了醋酸辛酯和沉香醇在水中的嗅觉阈值,这项研究结果表明了乳酸菌作为食品级表达载体的应用前景(Igor等,2007)。马乐辉等(2009)采用试管稀释法,研究不同来源的食品级的18株乳酸球菌、15株乳酸杆菌和5株双歧杆菌对nisin的敏感性,初步筛选出17株以nisin作为食品级筛选标记的受体乳酸菌,同时筛选出21株食品发酵、保鲜与贮藏过程中的nisin抗性乳酸菌。1.2食品水平诱导表达系统1.2.1糖运转和代谢糖在乳酸菌工业发酵中具有重要的作用,因此对糖诱导及其利用进行了较为深入的研究。有很多与糖转运和代谢有关的基因组合成操纵子,可以在转录水平进行调控。目前最具有代表性的是乳酸乳球菌的乳糖诱导表达系统。国外用破伤风毒素C片段(TTFC)作模型抗原,获得了许多乳酸菌用于免疫接种的知识,开辟了乳酸杆菌作为活疫苗的真实前景(Ho等,2005)。1.2.2启动子和33复制子φ31诱导型表达系统是基于乳酸菌噬菌体φ31的中期启动子而构建的,可被φ31侵染而诱导表达,并可导致宿主菌的崩解,该系统由φ31启动子和φ31复制子组成。系统表达的一个辅助因素是载体上含有一个同样也受噬菌体侵染所诱导的φ31复制原点(oriφ31),诱导后呈现高效复制。1.2.3激酶nisk基因检测乳链球菌素nisin亦称乳链菌肽,是一种天然、高效、安全、无毒副作用的食品防腐剂。在NICE系统的nisin自主调节过程中,组氨酸激酶NisK作为nisin的传感器,NisR蛋白作为反应调节子激活靶基因的转录。一旦信号如胞外nisin存在,nisin结合到受体NisK上,随后,NisK通过磷酸化激活NisR,被激活的NisR在nisA启动子处诱导nisin操纵子(Kuipers等,1998;Neu等,2003),该系统表达的产物可以达到细胞总蛋白的10%～60%,产量提高数千倍,其诱导调节过程如图1所示。1.2.4丝裂霉素调节rro和tec基因表达通过对乳酸杆菌温和噬菌体ψorlt基因全序列的测定和分析,发现了一个与溶原转变有关的调控区,它是由与转录方向相反的2个基因启动子(P1和P2)组成,分别控制rro基因(编码一个阻遏物)和tec基因(编码Cro的拓扑异构体)的表达。P2的表达受到Rro阻遏,加入丝裂霉素可以缓解这种阻遏。通过设计一个热不稳定性的Rro的阻遏变异体Rrol2,构造了温控表达系统。1.2.5产酸的ph依赖启动子乳酸菌最主要的特征之一是产乳酸,pH诱导的表达系统是根据LAB的产酸特点发展而来的。LAB的pH依赖性启动子常会对其他的环境因子产生应答。在0.5mol/mL的NaCl存在下,这种诱导表达产物活性可以提高1000倍以上。1.3异源性基因的转移传统的乳酸酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)的异源性基因。如果将带有抗生素抗性基因的菌株投放到环境或人体、动物体内,由于抗性基因有转移的可能,将会带来严重的后果。最有效的方法是使用对人体安全的食品级筛选标记来构建载体。1.3.1isin和抗nisin特性的比较nisin是乳酸乳球菌产生的由34个氨基酸组成的抗菌素,是一种高效无毒的食品添加剂,菌株产生nisin和抗nisin的特性通常是共存的。很多工业菌株都具有nisin抗性,限制了它的应用范围。Takala等(2002)构建了一个包括pSH71的复制子、选择性标记nisI基因及启动子P45食品级克隆载体pLEB590,并在L.lactis成功地表达了来源脯氨酸亚氨基肽酶的基因pepi。1.3.2去除热应激蛋白嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)含有一个3.2kb的质粒,该质粒有2个开放阅读框repA和shsP,后者的基因产物是热应激蛋白(Geis等,2003),把该质粒去除后,Strep.thermophilus对热和酸的抵抗力明显降低。如果将该基因克隆到没有该基因的Strep.thermophilus,该菌又能在60℃和pH3.5条件下生长,利用shsp和Emr作为标记构建质粒,转化Strep.thermophilus和Lc.lactis,得到高的筛选效率(Demerdash等,2003)。1.3.3supb基因缺失型级载体由乳酸乳球菌一个质粒的最小复制子、乳球菌的赭石突变抑制基因supB及一段人工合成的含有11个限制酶酶切位点的多克隆位点组成一个乳酸菌食品级载体pFG1,载体大小约为2kb。当乳酸乳球菌嘌呤生物合成途径中的基因发生赭石突变时,表现为嘌呤营养缺陷型。而pFGl载体中的supB基因产物可以抑制这种营养缺陷型,因此supB基因可作为选择标记。Sorensen等(2000)在pFG1的基础上构建了一个新的食品级表达载体pFG200。pFG200以琥珀突变抑制基因为选择标记,并且除了一小段多克隆位点外全部由乳球菌DNA构成,在不含嘧啶培养基中可有效地选择和保持含克隆载体的菌株。1.3.4lacf基因缺失菌株的构建利用糖类选择性标记报道较多,包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。目前,在乳酸菌的糖类利用中,以乳糖操纵子研究得最为深入。将完整的乳糖操纵子插入到无质粒的乳酸乳球菌MG5276的染色体中,然后通过双交换同源重组使LacF基因失活,细菌表型为Lac-,当将克隆有LacF基因的质粒导入LacF缺陷株时,细菌就恢复了Lac+表型,并可以通过含乳糖指示剂的溴甲酚紫平板来筛选重组菌落。此外还可利用乳酸菌具有发酵特殊糖类的表型特征构建新的食品级载体,蜜二糖是乳酸菌的一个特殊的发酵底物,Labrie等(2005)利用棉子糖乳球菌的aga基因的Mel+表型特征开发了新的选择标记。2通过黏膜免疫检测siga抗体乳酸菌为厌氧或微厌氧的革兰氏阳性、非致病菌,能在呼吸系统、消化系统和泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;作为基因工程菌可简化表达产物的后期处理工艺;同肠胃外免疫途径相比,可通过黏膜免疫产生sIgA抗体;具有免疫佐剂作用及对胆汁酸的抵抗力(吕晓英等,2005)。现在构建乳酸杆菌口服基因工程苗表达载体的条件都已逐渐完善,只是乳酸杆菌如何诱导小肠产生局